QM基因对小鼠成骨细胞MC3T3-E1成骨活性的影响

论文摘要

QM蛋白,一种被认为有抗癌活性的核糖体蛋白,在脊椎动物发育软骨中有特异性表达,并且在骺软骨区中的表达明显高于增殖区软骨中的表达水平。体内实验进一步证实,在与生长面相邻的成骨细胞的毛细管区以及在覆盖了生长面的骨膜内和骨化的二级中心区,QM表达水平最强。体外检测也发现在矿化前的成骨细胞中QM蛋白的表达水平比矿化后的水平高。以上实验结果提示我们:QM蛋白在骨的生长和代谢中很可能起着举足轻重的作用。本研究以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,主要研究了QM基因在成骨细胞骨质形成和代谢中的作用。首先,通过RNAi （RNA interference）技术沉默掉QM基因的表达。结果发现,小鼠成骨细胞MC3T3-E1转染pSilencer3.1-H1/puro/QM质粒第3天后相对于转染空质粒的细胞出现生长速度减慢,乃至死亡的现象。转染后第8天,细胞出现大量死亡。这些结果证实了QM蛋白对小鼠成骨细胞MC3T3-E1来说的确是个很重要的蛋白,沉默掉其表达会引起细胞的死亡。为了进一步研究QM基因在成骨细胞骨质形成和代谢中的作用,我们构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A/QM并转染到MC3T3-E1中建立过表达QM蛋白的细胞系,研究其表达上调后对细胞的影响。研究结果显示,过表达QM的细胞较正常表达QM的细胞,碱性磷酸酶的活性上升,矿化结节数增多,成骨细胞中一些与生长、分化及矿化有关的特异基因的mRNA转录水平也有所提高,而流式细胞仪检测结果表明过表达QM后并不影响细胞周期的改变。本研究初步证明了过表达QM后对小鼠成骨细胞MC3T3-E1的分化以及矿化都有一定的影响,这为QM基因在体内骨质的生长和代谢中所起的作用及其作用通路等后续研究提供了科学的依据,并且为治疗骨质疏松症药物的筛选提供了新的思路。

论文目录

• 第1章 引言
• 1.1 课题背景及意义
• 1.1.1 骨质的形成与调控
• 1.1.2 QM 基因及QM 蛋白
• 1.1.3 RNAi 技术的发展及应用
• 1.2 论文各部分的主要内容
• 第2章 实验材料与实验方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要实验材料与试剂
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA 干扰的目的序列选取
• 2.2.2 插入载体的序列设计及合成
• 2.2.3 载体的处理
• 2.2.4 胶回收
• 2.2.5 引物与处理好的载体的连接
• 2.2.6 氯化钙法制备感受态细菌
• 2.2.7 小鼠成骨样细胞MC3T3-E1 的培养
• 2.2.8 细胞的转染
• 2.2.9 总RNA 的提取
• 2.2.10 RT-PCR
• 2.2.11 胶回收
• 2.2.12 质粒DNA 提取（碱裂解法）
• 2.2.13 DNA 序列分析
• 2.2.14 pcDNA3.1/myc-His A/QM 融合基因表达载体的构建与鉴定
• 2.2.15 QM 基因稳定表达的小鼠成骨细胞MC3T3-E1 细胞株的建立
• 2.2.16 免疫印迹（Western Blot）
• 2.2.17 BCA 法测定蛋白质含量
• 2.2.18 细胞周期分布分析（PI 染色法）
• 2.2.19 成骨细胞碱性磷酸酶活性的测定
• 2.2.20 茜素红染色法测矿化结节
• 2.2.21 统计学分析
• 第3章 MC3T3-E1 细胞中QM 蛋白对成骨活性的影响
• 3.1 利用RNAi 技术对小鼠成骨细胞MC3T3-E1 中QM 基因的功能研究..
• 3.1.1 RNAi 质粒的构建
• 3.2 稳定过表达QM 蛋白的MC3T3-E1 细胞系的建立
• 3.2.1 PCR 扩增QM 基因结果
• 3.2.2 PCR 产物法鉴定T/A 克隆
• 3.2.3 pcDNA/QM 的重组鉴定
• 3.2.4 Western Blot 检测MC3T3-E1 细胞中转染QM 蛋白表达状况
• 3.2.5 稳定过表达QM 细胞系的筛选
• 3.3 过表达QM 对MC3T3-E1 的影响
• 3.3.1 过表达QM 蛋白对细胞周期的影响
• 3.3.2 过表达QM 蛋白对细胞ALP 的影响
• 3.3.3 过表达QM 蛋白对细胞形成矿化结节的影响
• 3.3.4 过表达QM 蛋白对成骨细胞标志基因mRNA 表达水平的分析
• 第4章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 声明
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果