抗性和敏感菜蛾啮小蜂（Oomyzus sokolowskii）对杀虫剂的敏感性与AChE基因克隆

论文摘要

本文主要从抗性和敏感菜蛾啮小蜂（.Oomyzus sokolowskii） AChE对杀虫剂的敏感性、抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace基因克隆与序列分析等两个方面初步研究菜蛾啮小蜂的抗药性。采用玻管药膜法测定了抗性和敏感菜蛾啮小蜂对甲胺磷、阿维菌素的敏感性,其结果表明,敏感菜蛾啮小蜂对甲胺磷、阿维菌素的敏感性显著高于抗性菜蛾啮小蜂,田间抗性菜蛾啮小蜂对甲胺磷的抗性倍数为13.8～20.4倍,对阿维菌素的的抗性倍数为14.3～18.3倍。抗性品系菜蛾啮小蜂对乙酰胆碱酯酶的敏感度显著下降。应用同源克隆策略,利用RT-PCR结合RACE技术克隆了菜蛾啮小蜂ace基因cDNA,获得抗性和敏感菜蛾啮小蜂cDNA全长序列各一个,其长度都为2439bp,包含一个1920bp的ORF,翻译639个氨基酸。通过生物信息学分析,确定ace2基因,命名为OS-ace2R和OS-ace2S;并且在OS-ace2R序列分析发现2处突变位即K424R （AAG to AGG）和F394L （TTT to CTT）。但是通过蛋白质同源建模分析,其K424R （AAG to AGG）和F394L （TTT to CTT）对其三维结构没有影响,可能与菜蛾啮小蜂抗药性无关。此外,根据8种与菜蛾啮小蜂相近的昆虫ace1基因序列,获得抗性和敏感菜蛾啮小蜂acel基因片段,命名为OS-ace1R1和OS-ace1S1;其序列长1184bp,翻译成394个氨基酸序列,该段序列包括了所有昆虫乙酰胆碱酯酶基因都具有的保守FGESAG。通过序列分析,OS-ace1R1中存在2个突变点苯丙氨酸F207缬氨酸V （TTT to GTT）和丝氨酸S130脯氨酸P （TCT to CCT）；经过蛋白质同源建模分析,其F207V处于酰基口袋致使酰基口袋变大,从而导致AChE敏感性降低,可能与抗药性有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文章综述
• 1. 昆虫ACE基因研究进展
• 1.1 昆虫ace基因的结构
• 1.2 昆虫ace基因的类型及分子进化
• 1.3 乙酰胆碱酯酶的结构
• 1.4 昆虫ace基因突变与抗药性的关系
• 2 寄生蜂的研究进展
• 2.1 菜蛾啮小蜂的研究概况
• 2.2 寄生蜂抗药性的研究进展
• 3 本课题研究的意义
• 第2章 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ACHE对杀虫剂的敏感性
• 1. 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 供试试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试剂配制
• 1.5 抗性和敏感菜蛾啮小蜂对杀虫剂的敏感性
• 1.6 抗性和敏感菜蛾啮小蜂AChE对杀虫剂的敏感性
• 1.7 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 杀虫剂对抗性和敏感菜蛾啮小蜂的影响
• 2.2 杀虫剂对抗性和敏感菜蛾啮小蜂AChE活性的影响
• 3. 小结与讨论
• 第3章 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ACE基因克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试昆虫
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 药品配制
• 1.1.4 分析软件
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace2基因克隆
• 1.2.1 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace2基因引物设计
• 1.2.2 菜蛾啮小蜂总RNA提取
• 1.2.3 逆转录合成cDNA
• 1.2.4 cDNA第一链合成
• 1.2.5 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace2基因中间片段和3'RACE扩增
• 1.2.6 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace2基因5'RACE扩增及T-A克隆
• 1.2.7 抗性和敏感ace2基因序列拼接及序列分析
• 1.3 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace1基因克隆
• 1.3.1 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace1基因中间片段引物设计
• 1.3.2 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace1基因中间片段克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性和敏感啮小蜂ace2基因片段和3'RACE扩增结果
• 2.2 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace2基因5'RACE扩增结果
• 2.3 抗性和敏感啮小蜂ace2基因全长序列及其分析
• 2.4 菜蛾啮小蜂ace2基因所编码的AChE结构及功能分析
• 2.5 抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace1基因中间片段及序列分析
• 2.6 该菜蛾啮小蜂ace1基因片段所编码的AChE结构及功能分析
• 3 小结与讨论
• 存在的问题与展望
• 参考文献
• 致谢