论文题目: 禽流感病毒H9N2亚型和鸡毒霉形体HS株主要抗原性基因的克隆与表达研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 胡思顺
导师: 毕丁仁,熊远著
关键词: 禽流感病毒,鸡毒霉形体
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 禽流感病毒(AIV)和鸡毒霉形体(MG)是危害世界养禽业的主要病原,对世界养禽业造成了巨大的经济损失。近年来,禽流感在我国开始流行,特别是2004年初高致病性禽流感在我国和部分亚洲国家爆发流行,不仅造成了养禽业的巨大经济损失,而且导致人类的感染和死亡,引起了世界各国政府和普通民众的高度重视。另外,鸡毒霉形体是所有禽类呼吸道感染中的最基础的病原之一,在鸡群中感染普遍,血清学阳性率高,可经蛋传播,而且经常与其他呼吸道疾病混合感染,给畜牧业生产造成了极大的经济损失。为了养禽业的稳定发展和人类健康,必须加强这两种疾病病原的主要抗原基因的分子生物学研究,为最终控制和消灭这两种疾病打下良好的基础。 本研究首先进行了禽流感病毒核蛋白(NP)、血凝素蛋白(HA)基因的克隆与表达研究。(1):采用RT-PCR方法,以AIV A/chicken/China/HSS2004(H9N2)株为材料,获得了NP基因的全长cDNA和HA基因的部分cDNA。(2):将获得的cDNA克隆入pMD18-T载体进行序列测定,测得NP基因cDNA序列长度为1525bp;HA基因cDNA序列长度为1172bp,HA切割位点附近的氨基酸组成分别是:R-S-SR↓G,切割位点附近氨基酸残基的这种组成符合低致病力毒株的分子特征。(3):与Genebank中基因序列的同源性比较分析得知,NP基因序列高度的保守性,具有型特异性,同亚型病毒间达97%,不同亚型病毒间亦达90%以上;HA基因与国内亚型病毒分离株间的同源性高达99%左右。说明国内的H9N2可能源自同一毒株。(4):构建了重组表达载体pKG-NP和pKG-HA,并在BL21 codon plus和BL21(DE3)中表达,结果pKG-NP在BL21 codon plus中获得了高效表达。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,融合蛋白GST-NP大小约为84kD,约占菌体总蛋白的20%,能与鸡抗AIV抗体发生明显的抗原抗体反应。(5):利用十二烷基肌酸钠(SKL)方法纯化了GST-NP包涵体,并经过包涵体变性、复性、透析和包埋过程,获得了较高纯度的重组NP。 本研究在前期研究工作的基础上,对一个来自鸡毒霉形体的、含有4个pMGA基因的重组质粒(MgW17)进行了亚克隆,得到了一个完整的pMGA基因(H-pMGA1.2),为更好地研究该基因产物的活性及高效表达,我们剔除了信号肽序列以及前端的跨膜疏水部分及膜内部分;将该DNA片段插入GST融合表达载体中并在BL21中进行了表达,表达产物大小约52kD,该产物为
论文目录:
摘要
Abstract
英文缩略词表
第一部分 禽流感病毒H9N2亚型核蛋白(NP)和血凝素(HA)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
第1章 禽流感文献综述
1．1 禽流感概述
1．2 禽流感历史及引起的危害
1．2．1 禽流感历史
1．2．2 禽流感最近在世界各地的流行
1．2．3 禽流感在国内的感染情况
1．2．4 禽流感的生态学与公共卫生学意义
1．3 病原学
1．3．1 禽流感病毒形态与大小
1．3．2 流感病毒化学组成
1．3．3 流感病毒的复制
1．3．4 流感病毒的致病性
1．3．5 流感病毒的抗原性变异与进化
1．3．6 流感病毒对外界环境的抵抗力
1．3．7 禽流感病毒的基因组结构
1．4 禽流感的流行病学
1．4．1 易感动物
1．4．2 禽流感的传播
1．4．3 潜伏期
1．4．4 发病率和死亡率
1．5 禽流感的临床症状
1．6 禽类感染禽流感后的病理变化特点
1．7 禽流感的诊断
1．7．1 病毒的分离鉴定
1．7．2 血清学诊断技术
1．7．3 分子诊断技术
1．8 禽流感的预防和控制
1．8．1 防止病毒的传入和散播
1．8．2 建立疫情的预警机制
1．8．3 封锁、隔离和消毒
1．8．4 疫苗接种和检疫
第2章 禽流感病毒血凝素疫苗研究进展
2．1 亚单位疫苗
2．2 重组疫苗
2．3 核酸疫苗
2．4 表位疫苗
2．5 转基因植物疫苗
第3章 禽流感病毒核蛋白研究进展
3．1 NP基因的结构
3．2 NP功能研究
3．3 NP在诊断中的应用
3．4 NP免疫学功能及其DNA疫苗研究
第4章 研究目的及意义
第5章 实验材料与方法
5．1 实验材料
5．1．1 病毒毒株、质粒、细菌及抗体
5．1．2 工具酶及主要生物学试剂
5．1．3 主要药品及化学试剂
5．2 主要试剂及溶液的配置
5．2．1 抗生素类
5．2．2 常用贮存液的配制
5．2．3 培养基
5．2．4 琼脂糖凝胶电泳试剂
5．2．5 α互补检查的试剂
5．2．6 碱裂解法质粒提取液
5．2．7 SDS—PAGE和Western—blot试剂
5．2．8 包涵体蛋白纯化试剂
5．3 实验方法
5．3．1 引物的设计与合成
5．3．2 病毒的增殖、收获及纯化
5．3．3 病毒RNA提取
5．3．4 RT—PCR及DNA片段的电泳检测
5．3．5 RT—PCR扩增产物回收与纯化
5．3．6 回收的目的DNA片段与克隆载体pMD18—T的连接反应
5．3．7 大肠杆菌DH5α或BL21 codon Plus感受态细胞的制备
5．3．8 连接产物的转化
5．3．9 α互补检查方法
5．3．10 重组质粒DNA的提取
5．3．11 重组质粒DNA鉴定
5．4 NP和HA基因的cDNA序列测定与分析
5．5 表达载体pKG—NP和pKG—HA的构建
5．6 外源基因的诱导表达与表达产物的初步鉴定
5．7 重组NP蛋白的纯化
5．7．1 重组NP蛋白包涵体的纯化
5．7．2 包涵体的溶解与复性
5．8 SDS—PAGE和Western—blot
5．8．1 SDS—PAGE
5．8．2 Western—blot分析
第6章 结果与讨论
6．1 禽流感病毒NP和HA基因的RT- PCR与克隆
6．2 禽流感病毒NP和HA基因DNA序列测定与分析
6．3 禽流感病毒NP和HA基因的表达
6．3．1 表达载体的构建
6．3．2 克隆基因的诱导、表达与检测
6．3．3 免疫学活性检测
6．4 讨论
6．5 结论
第2部分 鸡毒霉形体pMGA基因在大肠杆菌中的表达研究
第1章 鸡毒霉形体文献综述
1．1 鸡毒霉形体概述
1．2 鸡毒霉形体的致病机理
1．3 鸡毒霉形体结构蛋白研究进展
1．4 鸡毒霉形体病的现代检测技术
1．5 鸡毒霉形体膜蛋白血清学反应特性研究
1．6 鸡毒霉形体粘附因子
1．6．1 鸡毒霉形体粘附素蛋白(pMGA)研究
1．6．2 鸡毒霉形体HS株pMGA多基因族研究
1．6．3 pMGA基因的表达调控
1．7 鸡毒霉形体的其他粘附因子
1．7．1 GapA
1．7．2 PvPA
第2章 研究的目的和意义
第3章 实验材料和方法
3．1 实验材料
3．2 pMGA基因的克隆及表达策略
3．3 PCR引物设计
3．4 pMGA基因片段的PCR及克隆
3．5 重组表达质粒的构建与转化
3．6 外源基因的诱导表达与表达产物的初步鉴定
3．7 重组蛋白的包涵体的提取
3．7．1 重组蛋白包涵体的提取
3．7．2 包涵体变性、复性和纯化
3．8 重组蛋白Western—blot分析
第4章 结果与分析
4．1 pMGA基因的部分表达及免疫学活性检测
4．1．1 pMGA基因片段的克隆、重组表达质粒的构建及鉴定
4．1．2 GST—pMGA多肽融合蛋白的表达
4．1．3 Western—blot分析
4．2 pMGA基因的TGA同义突变及其表达
4．2．1 pMGA基因片段的扩增
4．2．2 含pMGA基因片段表达载体的构建
4．2．3 GST—pMGA多肽融合蛋白的表达
4．2．4 免疫印迹分析
4．3 讨论
4．4 结论
参考文献
致谢
发布时间: 2005-12-05
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