论文摘要
NRSE／RE-1序列与小鼠胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的关系前言神经系统疾病严重地威胁着人类的身体健康，其中帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓损伤等均是由于受损的分化成熟的神经细胞，不能通过神经细胞分裂增殖得到修复所引起。胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）来自囊胚内细胞团，在体外可长期自我复制并且具有分化出三个胚层细胞的多潜能性。很多研究表明其可在体外诱导分化为神经细胞，并可将其移植来修复神经系统的损伤。但是，目前人们仍不够了解胚胎干细胞向神经细胞分化的确切机制。有文献报道，REST／NRSF表达产物能与神经元分化基因启动子区域的NRSE／RE-1序列结合，抑制神经元分化基因的表达。在体内自然分化的神经细胞中，REST／NRSF表达明显下调，因此认为其为神经元分化的负向调节基因。本课题组已建立了将小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经元的“序贯诱导”法，并对胚胎干细胞向神经元分化机制做初步研究，研究结果表明：1、基因表达芯片研究证实，REST／NRSF在ESCs向神经细胞分化过程中明显降低，而其蛋白作用的含有NRSE／RE-1序列众多神经元分化基因的表达量却普遍升高。2、通过RNAi技术直接在转录水平上干扰REST／NRSF与神经元分化基因的结合，促进神经元基因的表达，实现了mESCs向神经细胞的诱导分化。本研究选择了部分含有NRSE／RE-1序列的基因，即P2ry12，Nptxr，Syp，BDNF，Syt2，Syt7，Ntrk3，Cdh4，Cacna2d3，Atp2b2，Rgs7。应用real-time PCR等方法进行精确定量分析其在体外应用“序贯诱导法”分化过程中的表达变化，研究其在胚胎干细胞向神经元诱导分化的作用机理，并探讨胚胎干细胞向神经元诱导分化的主导基因，及可能的分化标志基因。方法1、ESCs培养及诱导分化ESCs（鼠ES细胞系AB2.1由美国南加州大学医学院惠赠）按常规培养于饲养层细胞上。诱导分化时去饲养层细胞，重新接种于无包被的培养皿中，使用NSC培养液，逐渐更换为无血清NSC培养液。2、鉴定未分化及诱导分化后细胞（1）碱性磷酸酶染色鉴定未分化ESCs。（2）免疫荧光法检测神经干细胞及成熟神经元特异性抗原nestin、NCAM1、NSE、NeuN和GFAP。（3）NCAM1、DAPI复染测定分化比率3、筛选分化过程中主导基因采用real-time PCR法对筛选出的11个基因在未分化及分化后第4、10天，定量分析其变化规律。实验结果1、使用“序贯诱导法”可将ESCs大比例诱导分化为神经元样细胞未分化的ESCs聚集成团状生长，细胞排列紧密，集落边界清楚，碱性磷酸酶染色阳性。使用序贯诱导法可将ESCs大比例诱导分化为神经样细胞，光镜下观察细胞形态均一，胞体圆亮，突起细长。2、诱导分化第10天NCAM1免疫荧光染色测定分化比率为86.2％±5.5％3、Real-time PCR检测结果为筛选的含有NRSE／RE-1序列的11种基因，随诱导分化时间的延长表达增加。结论1、“序贯诱导法”可诱导ESCs高比率分化成熟神经元，诱导分化率可达86.2％±5.5％。2、含有NRSE／RE-1序列的基因表达上调与诱导ESCs分化为成熟神经元有关，可能为ESCs分化为成熟神经元的主导基因。3、Cacna2d3，Nptxr，P2ry12，Rgs7可做为胚胎干细胞向神经细胞分化的参考标志基因。