乙型肝炎病毒感染者外周CD4/CD8双阳性T（DPT）细胞的研究

论文摘要

人类乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染是全球范围的公共卫生问题,幼龄感染或在免疫力降低的状态容易转化为HBV慢性感染。在自限性急性乙肝患者体内,可检测到大量针对多病毒表位的特异性CD4+T辅助细胞（CD4+Th）和CD8+杀伤性T细胞（CD8+CTL）应答；而在慢性乙肝患者体内,抗HBV特异性细胞免疫应答低下甚至检测不到。人体和动物研究均已证实在HBV急性感染期间,若机体能诱导HBV核心抗原（HBcAg）特异性CD8+T细胞分泌IFN-γ;和TNF-α,则倾向于彻底清除HBV从而恢复健康。在慢性乙肝患者中,抗HBcAg/HBeAg特异性CD4+Th细胞应答强度显著下调,而在HBeAg转阴且预后较好的患者中上调,提示HBV特异性CD4+Th细胞在病毒清除中也发挥极为重要的作用。尽管以上研究均说明HBV特异性CD4+和CD8+T细胞所介导的免疫应答在HBV清除中发挥非常重要的作用,但对同时装备了CD4和CD8的CD4+CD8+双阳性T（DPT）细胞是否也参与HBV免疫应答,目前还不清楚。DPT细胞是CD4+和CD8+单阳性（sp）T细胞亚群的前体,一般认为在胸腺中,未成熟的DPT细胞经阳性选择和阴性选择发育成成熟的CD4sp或者CD8sp T细胞,然后分泌到外周血中发挥效应功能。基于这种经典的免疫学理论,通常认为DPT细胞仅存在于胸腺组织中。但是早在上个世纪八十年代就有学者发现人的外周血中也存在着少量的DPT细胞,但其功能并不十分清楚。最近的研究显示外周DPT细胞具有抗原特异性应答,提示外周DPT细胞可能是一类重要的T细胞亚群。鉴于HBV特异性CD4+和CD8+T细胞在HBV清除中所发挥的重要作用,理论推测外周血DPT细胞在HBV感染与控制中也十分重要,有必要对其进行系统的研究。首先,在HBV患者外周血中发现存在一定量的DPT细胞,与健康人群相比,HBV感染者外周DPT细胞比例显著的上调：健康人外周总的DPT细胞约占CD3+T细胞的0.5%（中位数值）,而慢性和急性HBV患者外周总的DPT细胞分别约占CD3+T细胞的1.0%（中位数值）和1.5%（中位数值）,说明HBV感染造成外周DPT细胞比例增加。进一步用CCR7和CD45RO抗体对这些细胞的类型进行分类以分析HBV患者外周DPT细胞表型,结果显示HBV患者外周DPT细胞行分类以分析HBV患者外周DPT细胞表型,结果显示HBV患者外周DPT细胞主要是一群高表达CD45RO的记忆性T细胞,其中70%的细胞为CCR7阳性,属中心记忆性T细胞。此外,通过系统分析这些细胞表面的一些特征分子,包括CD27, CD69, HLA-DR, CD38和CD62L,显示外周DPT细胞高表达激活标志HLA-DR（p<0.05）和趋化因子受体CD62L （p<0.05）。鉴于部分T细胞亚群同样表达CD4或CD3分子,如调节性T细胞（Treg, CD4+CD25+Foxp3+）,滤泡辅助性T细胞（Tfh, CD4+CXCR5+PD-1+）和NKT细胞（CD3+CD56+）等,因此分析了外周DPT细胞是否也同时表达这些细胞的标志分子。结果显示外周DPT细胞表面不表达Treg和Tfh细胞的标志物,但是有少量DPT细胞表达CD56。为研究HBV患者外周血DPT细胞比例上调的可能机制,首先在HBV抗原存在下,观察体外刺激DPT细胞是否能使其比例增加。复苏具有HBV特异性应答的急性患者外周血单个核细胞（PBMCs）,用HBV多肽刺激10天后检测DPT细胞的比例变化。结果显示HBV多肽刺激能够显著增加外周DPT细胞比例。例如,一位患者DPT细胞的比例从刺激之前的1.2%增加到4.1%。随后,通过CFSE增殖染料标记急性患者PBMCs, HBV抗原体外刺激细胞10天后检测CD4sp T细胞,CD8sp T细胞以及DPT细胞的增殖能力,同时用anti-CD3抗体刺激作为阳性对照。结果显示无论是HBV抗原刺激组还是阳性对照组,其外周DPT细胞CFSEdim的比例显著高于单阳性T细胞（37.4%CFSEdim DPT,6.22%CFSEdim CD8sp,2.5%CFSEdim CD4sp）,提示外周DPT细胞在HBV抗原刺激的情况下具有更高的增殖能力。鉴于已有文献报道单阳性T细胞激活后可以重新表达另外一种CD4或者CD8蛋白而成为DPT细胞（简称sp-DPT）,尚不清楚增殖实验中高比例的CFSEdim DPT细胞是否是由sp-DPT细胞增殖所造成。为了验证这种可能,通过流式分选的方法从具有HBV特异性应答的患者PBMCs中剔除CD4+和CD8+T细胞,然后用HBV多肽或者anti-CD3抗体刺激剔除了CD4+或者CD8+T细胞的PBMCs10天。结果显示体外anti-CD3抗体刺激确实能够诱导单阳性T细胞成为sp-DPT细胞,但是HBV多肽的刺激却不足以体外诱导sp-DPT的生成。该实验结果排除了HBV多肽体外诱导sp-DPT细胞的可能,证明了高比例的CFSEdim DPT细胞是由于DPT细胞的增殖造成的不是由于sp-DPT增殖所造成。为明确外周DPT细胞是否和单阳性CD4+或者CD8+T细胞一样具有HBV特异性应答,HBV多肽体外刺激急性HBV患者PBMCs10天,检测DPT细胞是否产生非杀伤性细胞因子（IFN-γ、TNF-α）以及杀伤性细胞因子CD107a。结果发现,HBV多肽能够刺激外周DPT细胞产生上述细胞因子,更重要的是外周DPT细胞分泌细胞因子的能力要显著高于单阳性CD4+和CD8+T细胞,说明这阳性患者所识别的HBV优势表位FLPSDFFPSV是否能够诱导外周DPT细胞产生特异性应答。结果显示HLA-A*02限制性HBV-FLPSDFFPSV的确能够诱导DPT细胞分泌效应分子；数据显示外周DPT细胞能够识别HLA-A*02所提呈的病毒表位肽并且分泌高水平多种效应细胞因子,提示外周DPT细胞可能在抗HBV病毒中发挥重要作用。在高压尾静脉注射HBV复制型质粒建立的急性HBV复制小鼠模型中,动态观察外周DPT细胞和HBV病程发展的相关性。首先,分析了小鼠外周DPT细胞是否具有和人外周DPT细胞一样的表型。数据显示小鼠外周DPT细胞也是一群CD44+CD62L+的中心记忆性T细胞,健康BALB/c小鼠外周血中DPT细胞比例不到CD3+T细胞的0.5%。但是在高压尾静脉注射HBV质粒后的第23天,外周DPT细胞的数目显著增加到了1%。值得注意的是,这群DPT细胞的数目在HBV彻底清除后又会回到正常的水平。在整个过程中,外周DPT细胞的激活状态和HBV病程发展呈现出相关性。用HBV多肽体外刺激清除小鼠外周DPT细胞同样可以使其分泌IFN-γ。上述小鼠实验表明外周DPT细胞频率和激活状态的动态变化跟HBV病程发展具有相关性,并且清除HBV小鼠外周DPT细胞能够产生HBV特异性应答。综上所述,HBV感染显著上调外周DPT细胞的比例,HBV抗原体外刺激能够造成DPT细胞大量增殖。与单阳性T细胞相比,外周DPT细胞能够分泌更强的效应细胞因子,包括杀伤性和非杀伤性细胞因子。小鼠实验证明了外周DPT细胞水平变化和HBV病程发展具有相关性,提示外周DPT细胞可能是一种重要的T细胞亚群参与宿主针对HBV的免疫应答。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 论文总结与创新点
• 文献综述
• 参考文献
• 附录1
• 参考文献
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 致谢