蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究

论文题目: 蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 韩颖颖

导师: 沈大棱,明凤

关键词: 查尔酮合酶,蝴蝶兰,类黄酮和花色素,表达,反式,基因家族,系统进化分析,分子进化,转基因烟草

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)原产于亚洲热带地区，具有很高的观赏价值和经济价值。类黄酮类色素是植物主要的花色素，而且在其它许多生物功能中发挥作用，如防紫外照射，植物——微生物间的相互作用以及雄性育性。查尔酮合酶(Chalcone synthase，CHS，EC2.3.1.74)是类黄酮合成途径的关键酶，催化一分子的香豆酰CoA与三分子的丙二酰CoA缩合生成4，5，7三羟基黄烷酮(narigenin chalcone)，是类黄酮合成的限速酶。 本研究利用一系列PCR方法克隆到3个新的蝴蝶兰查尔酮合酶基因。将它们分别命名为phchs3，phchs4和phchs5。首先，利用RT-PCR方法克隆到phchs3和phchs5的cDNA片段；利用常规PCR方法分离到phchs4的DNA片段。然后根据每个基因已知区域的序列设计反式PCR引物，进行反式PCR，得到全长基因。 Phchs3(GeneBank accession no．AY954515)包含有一个长为1173bp的开放读框，在保守的第60位氨基酸(半胱氨酸)密码子的第一个和第二个核苷酸之间存在一个长为103bp的内含子。其编码的蛋白与其它物种的CHS有61-65％的同源性，并且包含了大部分CHS保守的活性位点。我们还得到了该基因684bp 5’非翻译区序列。在Phchs3的启动子区存在许多CHS基因特有的顺式作用元件，如G-box，W-box，P-box和TACPyAT motif等。 Phchs4(GeneBank accession no．AY825502)包含有一个长为1173bp的开放读框，在保守的第60位氨基酸(半胱氨酸)密码子的第一个和第二个核苷酸之间存在一个长为109 bp的内含子。该基因编码由390个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白包含大部分CHS保守的活性氨基酸，与其它物种的CHS有61-65％的同源性。我们还得到了其618 bp 5’非翻译区序列。在phchs4启动子区发现了多种参与CHS基因表达调控的顺式作用元件。 Phehs5(GeneBank accession no．DQ089652)包含有一个长为1185 bp的开放读框，在保守的第61位氨基酸(半胱氨酸)密码子的第一个和第二个核苷酸之间存在一个长为159 bp的内含子。不管在核苷酸水平还是氨基酸水平，Phchs5与其它兰科植物和其它科属植物CHS的同源程度高于与已知的蝴蝶兰CHS序列之间的同源程度。 Southern杂交表明，蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族至少由4个成员组成。 同源进化分析表明，兰科CHS基因在蝴蝶兰、石斛兰和Bromoheadia三个属形成以前就已经分歧为两个亚家族。Phchs5属于缓慢进化的一支；phchs3和phchs4属于加速进化的一支。蛋白序列同源比较表明，许多CHS活性必须的氨基酸残基在加速进化的一支中不存在。 以半定量RT-PCR方法对三个蝴蝶兰CHS基因在处于不同发育阶段的不同花器官中的表达进行了鉴定。Phchs5是花器官中表达最强的基因，它特异的在花色素积累时期的花瓣和唇瓣中表达(阶段1至4)。Phchs5在花瓣中最高水平的表达发生在阶段3和4。这一时期，花色素在该组织中的积累速度最快。Phchs3和phchs4在花器官中的表达水平较phchs5低。Phchs3在发育早中期的着色的花被中表达，也在发育晚期无色的生殖器官中表达。与Phchs5相似，phchs4仅在花瓣和唇瓣中表达。它在早期的花瓣(阶段1-3)和晚期的唇瓣中微量表达(阶段4)。上述结果为蝴蝶兰单个CHS基因的差异表达提供了新的事实依据。 对phchs5在不同蝴蝶兰花色品种中的表达进行鉴定分析，结果进一步证明该基因特异的在花瓣和唇瓣中表达，其表达水平明显与组织中花色素积累水平一致。它在“紫红”品系(紫红花瓣)花瓣中的表达水平大大高于“黄花红唇”(黄色花瓣)和“白花黄唇”(白色花瓣)花瓣中的水平。 以phchs3的外显子2序列作为目的基因转化烟草可以使转基因植物的花瓣颜色加深。这些数据证实了phchs3在花色素合成中的功能，为过量表达蝴蝶兰CHS基因来进行其它植物的花色改良奠定了理论基础。

论文目录:

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英文摘要

第一章 查尔酮合酶基因研究进展及其在植物花色改良中的应用

1 查尔酮合酶基因简介及研究蝴蝶兰查尔酮合酶基因的意义

2 植物查尔酮合酶的功能

2.1 查尔酮合酶是花色素合成的关键酶

2.2 查尔酮合酶在植物防御反应中的作用

3 查尔酮合酶基因家族成员的分子进化及其多样性表达的调控

3.1 查尔酮合酶在多数植物中由多基因家族编码

3.2 查尔酮合酶基因家族成员的特异性表达

3.3 查尔酮合酶基因家族成员的进化及其与特异性表达的关系

3.4 查尔酮合酶基因超家族成员简介

4.查尔酮合酶基因表达调控的顺式作用元件和反式作用因子

4.1 ACE元件

4.2 H-box

4.3 Anther-box

4.4 TACPyAT序列

4.5 Myb类转录因子

5 查尔酮合酶基因在基因工程花色改良和转基因反义抑制研究中的应用

5.1 直接导入色素合成的有关基因以诱导色素合成

5.2 利用反义RNA技术抑制花色素合成酶基因的表达

6.蝴蝶兰查尔酮合酶基因的研究现状及其研究意义

参考文献

研究思路和技术路线

第二章 蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员的克隆和序列分析

1 材料与试剂

1.1 植物材料

1.2 细菌载体与主要试剂

1.3 PCR引物序列

1.3.1 用于扩增phchs3的引物

1.3.2 用于扩增phchs4的引物

1.3.3 用于扩增phchs5的引物

1.4 主要的仪器设备

2 方法

2.1 蝴蝶兰花苞总RNA的提取

2.1.1 RNA提取过程中的注意事项

2.1.2 提取方法

2.2 cDNA第一链的合成

2.3 RT-PCR扩增phchs3和phchs5 cDNA片段

2.4 蝴蝶兰基因组DNA的抽提

2.4.1 SDS抽提缓冲液的配制

2.4.2 抽提方法

2.5 PCR扩增phchs4基因片段

2.6 反式PCR方法扩增CHS基因上下游序列

2.6.1 酶切基因组DNA

2.6.2 酶切产物的自连

2.6.3 反式PCR扩增

2.7 PCR产物的T-A克隆

2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.9 大肠杆菌的转化

2.10 大肠杆菌质粒的小量提取

2.11 DNA序列测定及序列分析

2.12 Southern杂交

2.12.1 限制性内切酶消化DNA以及DNA片段的电泳分离

2.12.2 限制性酶切片段的转移和DNA在膜上的固定

2.12.3 探针的标记

2.12.4 预杂交、杂交和洗膜

2.12.5 膜的封闭、抗体孵育和膜的洗涤

2.12.6 信号检测

3 结果和讨论

3.1 phchs3基因的克隆和序列分析

3.2 phchs4基因的克隆和序列分析

3.3 phchs5基因的克隆和序列分析

3.4 蝴蝶兰查尔酮合酶由多基因家族编码

4.小结

第三章 蝴蝶兰查尔酮合酶基因的进化分析以及兰科植物查尔酮合酶基因分子进化的机制

1.材料和方法

1.1 用于研究分析的DNA序列来源

1.2 序列的同源性比较和进化树的构建

1.3 相对速率检验

2.结果和讨论

2.1 蝴蝶兰phchs3、phchs4和phchs5核苷酸序列的比较

2.2 蝴蝶兰(兰科植物)CHS基因的复制和分歧

2.3 蝴蝶兰(兰科植物)查尔酮合酶基因的异质性(heterogeneous)进化

2.4 分子钟检测与兰科CHS亚家族(Orchid CHS groups)的进化速率

3.小结

第四章 蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员的差异表达调控

1.材料和试剂

1.1 植物材料

1.2 主要试剂

1.3 半定量RT-PCR引物序列

2.方法

2.1 蝴蝶兰组织总RNA的提取和cDNA第一链的合成

2.2 半定量RT-PCR

2.2.1 以actin转录物的扩增量对cDNA相对定量

2.2.2 RT-PCR反应扩增目的基因

2.3 phchs5全长基因转录的鉴定

3.结果和讨论

3.1 蝴蝶兰花器官和发育阶段的划分

3.2 蝴蝶兰CHS基因的组织和发育特异性表达

3.3 Phchs5在不同蝴蝶兰花色品种中的表达

3.4 对phchs5全长基因转录情况的鉴定

第五章 蝴蝶兰查尔酮合酶基因phchs3 cDNA片段的原核表达与真核表达

1.材料

1.1 植物材料

1.2 细菌载体与主要试剂

1.3 主要的仪器设备

2.方法

2.1 phchs3-1的克隆(第二章2.1至2.3)

2.2 phchs3-1的原核表达

2.2.1 原核表达载体的构建

2.2.2 目的基因的诱导表达和SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳

2.3 phchs3-1在烟草中的表达

2.3.1 真核表达载体的构建

2.3.2 农杆菌感受态的制备

2.3.3 农杆菌的转化

2.3.4 农杆菌转化子的鉴定

2.3.5 农杆菌介导的烟草的转化

2.3.5.1 农杆菌的培养

2.3.5.2 烟草的转化

2.3.6 转基因烟草的鉴定

2.3.6.1 以PCR方法对转基因烟草进行初步鉴定

2.3.6.2 转基因烟草的Southern杂交鉴定

2.3.6.2.1 烟草基因组DNA的提取、限制性内切酶酶切以及DNA片段的电泳分离

2.3.6.2.2 DNA片段向尼龙膜的转移、固定、Southern杂交和信号检测

2.3.6.3 外源基因在转基因烟草中的表达

3.结果和讨论

3.1 phchs3-1的序列分析

3.2 Phchs3-1的原核表达

3.3 转基因烟草

4 小结

参考文献

发表的论文

致谢

发布时间: 2007-06-28

参考文献

• [1].银杏叶黄酮积累相关基因克隆及查尔酮合成酶基因启动子功能研究[D]. 李琳玲.河北农业大学2010
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