RNA干扰沉默STAT3基因对肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株的影响研究

论文摘要

肝细胞癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一,其发生、发展过程受诸多因素的影响。传统的放疗、化疗及手术治疗手段仍不能获得理想治疗效果。为此,基因治疗成为目前肝癌的研究热点。信号转导和转录激活因子（signal transducers and activators of transcription, STATs）是研究干扰素诱导基因转录时首次鉴定的一个胞浆蛋白家族。研究发现,STATs具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演变,其中以STAT3尤为活跃。STAT3信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关,该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化,目前已被定义为癌基因。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是近年发现的一种重要的转录后水平的基因沉默方式。它能触发某种转录后监控程序,导致特定mRNA单链的降解。本实验利用RNAi技术,设计短发夹样RNA（small hairpin RNA, shRNA）并构建靶向STAT3的shRNA-DNA质粒,筛选稳定表达小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株,体外研究siRNA稳定和特异性诱导肝癌STAT3基因转录后沉默并逆转其恶性表型的能力,探索肝癌治疗新方法。目的:探讨应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子（STAT3）基因对肝癌HepG2及SMMC-7721细胞的影响。方法:针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建靶向抑制STAT3基因表达的短发夹双链RNA（shRNA）真核表达载体pGenesil-1-shRNA-STAT3,将其转化DH5α大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;将鉴定正确的重组表达质粒用脂质体LipofactaminTM2000转染人肝癌细胞HepG2及SMMC-7721细胞。通过半定量RT-PCR、Western blot检测STAT3基因mRNA和蛋白水平的表达情况,采用MTT实验、流式细胞术检测转染后细胞增殖及细胞周期的变化。结果:成功构建了pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3重组质粒,并转染HepG2及SMMC-7721肝癌细胞;半定量RT-PCR、Western blot结果显示,重组质粒转染组细胞的STAT3基因的mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组;MTT实验、流式细胞术检测结果显示,重组质粒转染组细胞的增殖明显抑制,S期细胞显著减少,G0-G1期细胞显著增加,并出现凋亡现象。结论:pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3转染HepG2及SMMC-7721肝癌细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制肝癌细胞的生长及增殖,促进癌细胞凋亡,为肿瘤基因治疗的RNAi策略提供了实验依据。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分：构建靶向抑制STAT3 基因的shRNA 重组表达载体
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第二部分：pGenesil-1-shRNA-STAT3抑制肝癌细胞STAT3基因表达的实验研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述：STAT3 基因与肿瘤的基因治疗
• 致谢
• 攻读学位期间发表文章及参与课题研究