接触DNA检材提取纯化方法的比较及法医学应用

论文摘要

接触DNA （touch DNA）检验是法医DNA检验的难点和热点之一。法医鉴定中的接触DNA检材,是指含有人体皮肤粘膜的脱落细胞的检材,包括含口腔脱落细胞的检材、含体表脱落细胞的检材、人体排泄物或分泌物等。凡是与人体皮肤粘膜接触过的物品,都可能留下接触者的脱落细胞。这些留有脱落细胞的物证可以存在于犯罪现场,也可存在于犯罪嫌疑人及被害对象的衣物、用具等客体上。随着犯罪分子反侦察手段的日益狡猾,明显的生物物证（精斑、血斑、毛发、人体组织等）常被有目的地销毁和破坏,而来自人体的代谢脱落细胞由于微小痕量,常被忽略,如遗留在烟蒂、饮料罐、果核、口香糖上的口腔脱落上皮细胞,遗留在手套、衣物、帽子、指纹上的皮肤脱落上皮细胞,等等。对于这些潜在的微量生物物证,一旦成功地获得了关键物证的DNA分型,往往就能够成为案件侦破的关键线索,并为案件定性及法庭量刑提供科学证据。如何从微量接触检材中提取到足够的DNA以满足法医学检验的需要,选择合适的提取方法非常关键,是法医物证检验工作者最关注的难题之一。接触DNA检材与常见的生物检材如血痕、精斑相比,属于疑难生物检材。首先,肉眼观察很难判断接触细胞在载体上的具体部位,盲目提取难以获得所需靶细胞；其次,擦拭面积太大会降低靶DNA的浓度,并带来外源物质的污染和干扰；第三,接触DNA检材含有的DNA往往是微量的,属于低拷贝数目（Low copy number,LCN）模板,即“DNA含量少于l00pg,相当于15个双倍体或30个单倍体细胞的生物样本”。因此接触DNA检验不同于常规生物检材的DNA检验,更需系统研究。目前关于接触DNA提取纯化方法的文献很多,概括起来有Chelex法、磁珠法、有机溶剂法（有机法）、过柱法、硅珠法、硅胶膜法等。但多为针对某种方法对某种类型接触DNA的提取或案例报道,对不同提取纯化方法获得的现场不同类型的接触DNA的质与量的横向比较缺乏系统研究。本研究采用Quantifiler人类DNA定量试剂盒（AB, USA）实时定量技术对目前常用的提取纯化方法包括Chelex法、磁珠提取法（DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法）、有机溶剂提取法、Microcon过柱法提取的接触DNA进行定量,同时用Identifiler或Sinofiler复合扩增系统（AB,USA）扩增,在AB 3130遗传分析仪上进行STR （short tandem repeat,短串联重复）分型。综合DNA定量和STR分型结果,对各种提取纯化方法获得的DNA的质和量进行评估和系统比较,以建立有效的接触DNA提取纯化方法。1. Chelex法提取接触DNA的实时定量研究对使用后放置1个月以内的30个饮料瓶口或吸管、30个矿泉水瓶（杯）口分别采用不洗涤直接加Chelex-100提取与洗涤+Chelex-100的方法提取DNA,通过PCR定量和STR检测,比较2种处理方式获得的DNA平均含量、IPC Ct值、STR检验成功率；对使用后放置1个月以内的10个新鲜饮料瓶口或吸管,使用后分别放置1个月和放置2个月的20把牙刷、20枚烟蒂,分别采用洗涤+Chelex-100和洗涤+Chelex-100+蛋白酶K（PK）的方法提取DNA,通过PCR定量和STR检测,比较2种处理方式获得的DNA平均含量、IPC Ct值、STR检验成功率。研究结果表明,Chelex-100提取前加浸泡洗涤的步骤,可去除部分可溶性杂质,有利于提高获得的DNA量和STR检验成功率,同时降低反映PCR抑制物存在的IPC Ct值。室温放置1个月左右的新鲜接触DNA检材用Chelex法提取时,是否加蛋白酶K对提取的DNA量和STR检验成功率无显著影响；室温放置2个月以上的接触DNA检材用Chelex法提取时,加蛋白酶K消化后获得的DNA量和STR检验成功率均高于不加蛋白酶K的样品,差异有显著性意义。本研究对180份10种实际案件的接触DNA检材用Chelex法提取,烟蒂获得的平均DNA含量最高达175.85 ng,剃须刀较低为7.80 ng。除烟蒂、口香糖采用常规体系提取外,其它检材采用小体系提取,平均DNA浓度均在0.2ng/μl以上,采用2μll模板复合扩增,除衣服、剃须刀的STR分型成功率较低为50%外,其它检材的STR分型成功率均在60%以上。2.磁珠法提取接触DNA的实时定量研究对烟蒂、牙刷、手套等3种接触DNA检材各10个分别采用95℃裂解液直接裂解、70℃裂解液直接裂解和预消化（TNE+SDS+PK）等3种前处理方式后用DNA IQ磁珠（Promega, USA）提取DNA,测定并比较三种前处理方式后用DNAIQ磁珠法提取获得的DNA平均含量和IPCCt值。研究结果表明,接触DNA检材采用先加TNE、SDS、PK等消化,然后再用磁珠纯化的方法获得的DNA量高于单纯用裂解液裂解的方法提取的DNA量,有助于提高微量和污染接触DNA检材的STR检验成功率。但该处理方法操作相对繁琐,耗时长,除了污染严重的微量接触DNA检材外,大部分接触DNA检材单纯采用直接裂解法就可以获得足以进行STR分析的DNA。裂解温度方面,95℃裂解与70℃裂解的DNA获得量无显著性差异。对151份8种实际案件的接触DNA检材采用95℃直接裂解的DNAIQ磁珠法在MaxwellTM 16自动仪上提取DNA。结果表明除果核平均DNA获得量为9.51ng以外,其它7种接触检材的平均DNA获得量均大于10ng。采用30μl的小洗脱体积,平均DNA浓度可达0.3ng/μl,采用8μl体系3μl模板扩增,检验成功率最低的果核也达60%。EQ国产磁珠法与DNA IQ磁珠法相比,不仅价格便宜,还少了1个裂解液洗涤和1个洗涤液洗涤的步骤,操作更为简单,但对接触DNA的提取效率无显著性差异。对138份6种实际案件的接触DNA检材在自动化工作站经EQ国产磁珠法提取DNA,采用8μl体系3μl模板扩增,除对饮料瓶口的检验成功率较低,为60%外,对烟蒂、口香糖、手套等接触DNA检材的检验成功率也能达到70%以上。因此也适合接触DNA的提取。3.5种接触DNA检材提取纯化方法的比较将稀释为lOng、100ng的标准品DNA,分别采用Chelex法、DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法、有机法、Microcon过柱法等5种DNA提取纯化方法处理,然后进行PCR定量,比较5种DNA提取纯化方法对标准品DNA的回收率。对烟蒂和牙刷2种常见的接触DNA检材分别采用Chelex法、95℃直接裂解的DNA IQ磁珠法和EQ国产磁珠法提取DNA,通过PCR定量和STR检测分析,比较3种提取方法提取的DNA平均含量、IPC Ct值和STR检验效果；对30例污染严重的接触DNA检材,先用TNE、SDS、PK消化,然后将消化液平均分成2份,1份用DNA IQ磁珠法纯化,1份用有机法抽提,通过PCR定量和STR检测分析,比较磁珠法与有机法对接触DNA的纯化效果；将Chelex法提取的15例5种接触DNA溶液用Microcon100超滤柱进行纯化浓缩,通过PCR定量和STR检测分析,比较Microcon过柱法浓缩前后的浓度、体积、IP Ct值及回收率。结果表明,Chelex法对DNA的提取无损失,磁珠法、有机法、Microcon过柱法对DNA的提取纯化均有不同程度的损失。5种提取纯化方法对DNA的回收率从高到低大致为Chelex法>Microcon过柱法>DNA IQ磁珠法>EQ国产磁珠法>有机法。Chelex法提取DNA,操作简单快速,整个提取过程均在一个离心管中进行,避免了DNA在提取过程中的损耗,对污染轻、杂质少的接触DNA检材,用Chelex法提取最为方便快捷。但Chelex法不能去除DNA溶液中的杂质和降解的DNA碎片,因此,Chelex法提取的陈旧接触检材的DNA进行STR扩增时,即使模板量在试剂盒推荐的范围内,也容易出现等位基因扩增不平衡的现象。磁珠法与Chelex法相比,虽然提取过程中会造成DNA的损失,但提取的DNA纯度高,能有效去除100bp以下的DNA小片段和样品中的色素、蛋白质等杂质,因此,STR扩增时峰高比较均衡,等位基因扩增不平衡的现象不明显。磁珠法与有机法对接触DNA的回收量和IPC Ct值虽然无显著性差异,但磁珠法避免了有机溶剂对操作者的潜在危害,操作简单,耗时短,因此,更适合微量、污染检材的DNA提取及自动化操作。Microcon过柱法操作简单,但对接触DNA的回收效果不一,100μl的起始体积,过柱浓缩后的体积在8-25μl之间,平均为15μl。过柱后,DNA浓度平均约增加5倍,对DNA的回收率平均为61%,但反映PCR抑制物存在的IPC Ct值无显著降低。同时,Microcon过柱法的成本也高于磁珠法。因此,Microcon过柱法对接触DNA的提取纯化应用有限,只适合污染轻的接触DNA的纯化浓缩。本研究通过对5种常见的提取纯化方法获得的DNA的质和量进行系统比较和评估,为规范法医检验中接触DNA检材的提取送检以及法医工作者如何根据检材、实验室设备等情况选择合适有效的接触DNA提取纯化方法提供了科学依据,有利于提高接触DNA检材的检验成功率,充分发挥接触DNA检材的证据价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一章 Chelex法提取接触DNA的实时定量研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二章 磁珠法提取接触DNA的实时定量研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 附图
• 第三章 5种接触DNA检材提取纯化方法的比较
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 附图
• 全文小结
• 附录 英文缩略语对照表
• 攻读学位期间成果
• 致谢