卵叶娃儿藤生物碱的提取分离、类似物的合成及其抗肿瘤活性研究

论文摘要

卵叶娃儿藤（Tylophora ovata（Lindl.）Hook.ex Steud.）属于萝摩科（Asclepiadaceac）娃儿藤属（Tylophora）多年生匍匐性藤状草本,是中国传统的有毒中草药,这类植物为我国华南及西南地区常用的民间草药,娃儿藤碱类属于菲并吲哚里西定类生物碱,广泛存在于卵叶娃儿滕、老瓜头、牛心朴子等植物中,是一类具有高抗肿瘤活性的化合物,对肿瘤细胞具有明显的抑制作用。本论文研究了卵叶娃儿藤总生物碱提取工艺、具有抗肿瘤活性的卵叶娃儿藤生物碱及其类似物的合成与结构修饰,并对所得娃儿藤碱及其类似物用细胞学方法进行了抗肿瘤活性初步研究。1.研究了有机溶剂法、超临界C02提取法和微波辅助提取法提取卵叶娃儿藤总生物碱的工艺,对实验条件进行了正交设计试验优化,确立了溶剂法最佳工艺条件为：乙醇浓度90%、固液比1：25、提取温度80°C、提取2次、每次2h,卵叶娃儿藤总生物碱的得率可达0.388%；超临界C02提取法最佳工艺条件为：萃取温度50°C、萃取压力25MPa、萃取时间90min、夹带剂（95%乙醇）用量2.5mL/g,卵叶娃儿藤总生物碱的得率为0.25%；微波辅助提取法最佳工艺条件为：提取温度70°C、乙醇浓度90%、固液比1：20、提取时间15min,卵叶娃儿藤总生物碱的得率可达0.438%。相比而言,微波辅助提取的得率最高,有机溶剂提取法次之,超临界C02提取法最低。2.以藜芦醛、胡椒醛、3,4一二甲氧基苯乙酸、胡椒乙酸、（S）-L-脯氨酸等易得的原料为起始原料,以经典的Friedel-Crafts等反应为关键步骤,设计、合成了含有亚甲二氧基的对称性菲和不对称性菲的娃儿藤碱及其类似物：先合成a,p-二芳基丙烯酸（腈）,再用亚碘酰苯二乙酯（PIDA）对其关环成多取代基的9-羧基菲,然后脱去羧基,再和（S）-N-（三氟乙酰）-L-脯氨酰氯发生Friedel-Crafts反应得到多取代基-9-L-脯氨酰基菲,产物在三氟化硼乙醚存在下用三乙基硅烷还原羰基,然后脱去三氟乙酰保护基,最后在盐酸存在下用甲醛闭环得到目标产物。并以反应温度、反应时间、物料比、催化剂的种类和用量等因数,对合成过程中关键步骤的实验条件进行了优化。研究了氧化偶联条件和脱羧条件对得率的影响,以PIDA替代VOF3、VOC13试剂和紫外光照等偶联关环,试剂易于制备,反应条件温和,可操作性强,产率提高。用IR、1HNMR, MS和X射线单晶衍射仪等对目标化合物和部分中间体的结构进行了表征。3.以娃儿藤碱、类似物及卵叶娃儿藤总生物碱进行了体外抗肿瘤试验的初步研究,多角度研究了娃儿藤碱及类似物和总生物碱（TOHa）的体外抗肿瘤的作用。用MTT法检测了TOHa、娃儿藤碱、2,3,6,7-二亚甲二氧基-菲-9-[9,10-b]吲哚里西啶（BMPI）及DMPI对A549, HeLa, MGC-803, SGC-7091, SMMC-7721五种人肿瘤细胞生长的影响；用SPL检测、集落形成法检测BMPI对正常细胞生长及对A549细胞增殖能力的影响；用倒置显微镜、电镜、Gimesa染色法观察BMPI对A549细胞形态及细胞超微结构的影响；用AnnexinV FITC/PI法检测BMPI对A549细胞早期凋亡的影响。结果表明,娃儿藤碱及其类似物对体外培养的人肿瘤细胞具有显著的增殖抑制作用,且呈剂量依赖性,娃儿藤碱及其类似物都有显著的抗肿瘤活性,其中,BMPI活性更为明显,可以作为进一步研究的先导化合物。并从BMPI诱导肿瘤细胞凋亡角度出发探讨其作用机理,为进一步开发娃儿藤碱类似物做为抗肿瘤药物奠定理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 娃儿藤生物碱的研究进展
• 1.1 植物和动物中分离得到的娃儿藤碱及其结构类似物
• 1.1.1 Asclepiadaceae family（萝摩科）
• 1.1.2 Moraceae family（桑科）Ficus genus（榕属）
• 1.1.3 Danaidae（斑蝶科）Ideopsis Horsfield（斑蝶属）
• 1.2 娃儿藤生物碱的生物活性
• 1.2.1 抗肿瘤活性
• 1.2.2 抑制生物蛋白合成活性
• 1.2.3 抗白血病活性
• 1.2.4 抗菌、抗病毒及抗炎活性
• 1.3 娃儿藤生物碱的分离提取及分析检测
• 1.3.1 生物碱提取分离方法的概述
• 1.3.2 生物碱分析检测技术进展
• 1.4 娃儿藤类生物碱的全合成研究进展
• 1.4.1 叔菲酰胺金属化方法合成娃儿藤类生物碱
• 1.4.2 通过分子内的酰亚氨的Diels-Adler反应合成
• 1.4.3 N-（三氟乙酰）-L-脯氨酰氯的Friedel-Crafts酰基化反应
• 1.4.4 以（S）-（+）-谷氨酸或者（S）-α-氨基己二酸为手性试剂合成（s）-（+）-娃儿藤和cryptopleurine
• 1.4.5 以ω-氯代烯烃和叠氮化合物进行分子内关环合成娃儿藤碱
• 1.4.6 分子内双迈克尔反应合成娃儿藤碱
• 1.4.7 仿生合成法合成娃儿藤碱及类似物
• 1.4.8 4-（1-吡咯基）-环丁烯酮热扩环合成娃儿藤碱类似物
• 1.4.9 以磷酸酸化的环状氨基甲酸酯作为起始原料
• 1.4.10 其他方法合成娃儿藤碱类似物
• 1.5 本论文主要研究目的和意义
• 1.6 本论文主要研究内容
• 2 卵叶娃儿藤总生物碱的提取研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验材料与试剂
• 2.2.3 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 卵叶娃儿藤总生物碱分析方法的建立
• 2.3.2 有机溶剂提取卵叶娃儿藤总生物碱工艺研究
• 2提取卵叶娃儿藤生物碱工艺研究'>2.3.3 超临界CO₂提取卵叶娃儿藤生物碱工艺研究
• 2.3.4 微波辅助提取卵叶娃儿藤生物碱工艺研究
• 2.3.5 三种提取工艺的比较
• 2.3.6 卵叶娃儿藤中生物碱的检识
• 2.4 本章小结
• 3 娃儿藤碱（S-（+）-tylophorine）及类似物的设计与合成研究
• 3.1 娃儿藤生物碱及其类似物合成设计
• 3.1.1 娃儿藤生物碱类似物设计
• 3.1.2 娃儿藤生物碱类似物合成路线设计
• 3.2 娃儿藤生物碱及其类似物合成方法的研究
• 3.2.1 菲环骨架的合成方法研究
• 3.2.1.1 α,β-二芳基丙烯酸（睛）的合成
• 3.2.1.2 α,β-二芳基丙烯酸（腈）的氧化偶联
• 3.2.1.3 多甲氧基或亚甲二氧基菲的合成
• 3.2.2 （S）-N-（三氟乙酰）脯氨酰氯的Friedel-Crafts酰化反应
• 3.2.3 多取代的N-（三氟乙酰）脯氨酰基菲的还原和脱保护
• 3.3 本章小结
• 4 娃儿藤碱及其类似物的合成实验
• 4.1 测试仪器及试剂
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 试剂
• 4.2 S-（+）-娃儿藤碱（S-（+）-tylophorine）的合成
• 4.2.1 3,4-二甲氧基-反式-α-（3’,4’-二甲氧基苯基）-肉桂酸
• 4.2.2 2,3,6,7-四甲氧基-9-羧基菲
• 4.2.3 2,3,6,7-四甲氧基菲
• 4.2.4 （S）-N-（三氟乙酰）-L-脯氨酰氯
• 4.2.5 （S）-N-（三氟乙酰基）-2,3,6,7-四甲氧基-9-L-脯氨酰基菲
• 4.2.6 （S）-N-（三氟乙酰基）-2-[（2,3,6,7-四甲氧基菲-9-基）甲基]吡咯
• 4.2.7 （S）-2-[（2,3,6,7-四甲氧基菲-9-基）甲基]吡咯
• 4.2.8 娃儿藤碱（S-（+）-tylophorine）
• 4.3 2,3:6,7-二亚甲二氧基-菲-[9,10-b]吲哚里西定（BMPI）的全合成
• 4.3.1 甲硫基甲基亚砜（FAMSO）
• 4.3.2 2-（3’,4’-亚甲二氧基苯基）-1-（甲硫基）-1-（甲硫酰）乙烯
• 4.3.3 3,4-亚甲二氧基苯乙酸乙酯
• 4.3.4 胡椒乙酸
• 4.3.5 亚碘酰苯二乙酯（PIDA）
• 4.3.6 3,4-亚甲二氧基-α-（3’,4’-亚甲二氧基苯基）-肉桂酸
• 4.3.7 2,3,6,7-二亚甲二氧基-9-羧基菲
• 4.3.8 2,3:6,7-二亚甲二氧基菲
• 4.3.8.1 2,3:6,7-二亚甲二氧基菲单品培养
• 4.3.8.2 X射线衍射实验与晶体结构分析
• 4.3.9 （S）-N-（三氟乙酰基）-2,3,6,7-二亚甲二氧基-9-L-脯氨酰基菲
• 4.3.10 （s）-N-（三氟乙酰基）-2-[（2,3,6,7-二亚甲二氧基菲-9-基）甲基]吡咯
• 4.3.11 （s）-2-[（2,3:6,7-二亚甲二氧基菲-9-基）甲基]吡咯
• 4.3.12 2,3:6,7-二亚甲二氧基-菲-[9,10-b]吲哚里西定（BDPI）
• 4.4 2,3-二甲氧基-6,7-亚甲二氧基-菲-[9,10-b]吲哚里西定（DMPI）和2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基-菲-[9,10-b]吡哚里西定（MDPI）的全合成与分离
• 4.4.1 3,4-亚甲二氧基-α-（3’,4’-二甲氧基苯基）-肉桂酸
• 4.4-2 2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基-9-羧基菲
• 4.4.3 2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基菲
• 4.4.3.1 2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基菲单晶培养
• 4.4.3.2 X射线衍射实验与晶体结构分析
• 4.4.4 （s）-N-（三氟乙酰基）-2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基-9-L-脯氨酰基菲的制备
• 4.4.5 （S）-N-（三氟乙酰基）-2-[（2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基菲-9-基）甲基]吡咯和（s）-N-（三氟乙酰基）-2-[（2,3-二甲氧基菲-6,7-亚甲二氧基-9-基）甲基]吡咯
• 4.4.6 （s）-2-[（2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基菲-9-基）甲基]吡咯和（s）-2-[（2,3-甲氧基菲-6,7-亚甲二氧基-9-基）甲基]吡咯
• 4.4.7 2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基-菲-[9,10-b]吲哚里西定（MDPI）和2,3-二甲氧基-6,7-亚甲二氧基-菲-[9,10-b]吲哚里西定（DMPI）
• 4.4.8 DMPI和MDPI的HPLC半制备分离
• 4.4.9 2,3-亚甲二氧基-6,7-二甲氧基-菲-[9,10-b]吲哚里西定（MDPI）和2,3-二甲氧基-6,7-亚甲二氧基-菲-[9,10-b]吲哚里西定（DMPI）的结构解释
• 4.5 讨论
• 4.5.1 目标化合物和主要中间体的MS研究
• 1H NMR谱数据分析'>4.5.2 目标化合物的¹H NMR谱数据分析
• 4.5.3 MDPI和DMPI的半制备
• 4.6 本章小结
• 5 卵叶娃儿藤生物碱及类似物抗肿瘤活性初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 主要试剂及仪器
• 5.2.3 细胞培养
• 5.2.4 娃儿藤碱、DMPI、BMPI和娃儿藤总生物碱对人肿瘤细胞的细胞毒作用
• 5.2.5 BMPI碱对小鼠脾淋巴细胞（SPL）体外毒性实验
• 5.2.6 细胞分裂和集落形成能力检测
• 5.2.7 光镜观察细胞形态学改变
• 5.2.8 Gimsa染色后细胞核形态变化的观察
• 5.2.9 电镜观察细胞形态学改变
• 5.2.10 Annexin V-FITC检测早期凋亡
• 5.2.11 数据统计处理方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 肿瘤细胞的形态观察
• 5.3.2 娃儿藤碱及其类似物对人肿瘤细胞生长的影响
• 5.3.3 BMPI碱对小鼠脾淋巴细胞（SPL）体外毒性实验
• 5.3.4 BMPI对A549细胞分裂和集落形成能力的影响
• 5.3.5 光镜观察细胞形态学改变
• 5.3.6 Gimsa染色后细胞核形态变化的观察
• 5.3.7 电镜观察细胞形态学改变
• 5.3.8 Annexin V-FITC检测早期凋亡
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 6 结论
• 6.1 本论文结论
• 6.2 本文创新点
• 6.3 本文研究的后期工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 化合物的波谱数据
• 攻读博士学位期间已发表的相关论文和申请的专利