拟南芥磷脂酶Dδ在应答机械伤害中的功能研究

论文摘要

机械伤害是植物界中经常遇到的逆境之一，主要是指生物和非生物因素等胁迫因子对植物造成的损伤。这些因素主要包括暴风、冰雹等恶劣的环境条件、昆虫咬食或食草性动物的啃食等。每年，机械伤害给农业生产造成严重的损失，如农作物减产、果实品质下降，蔬菜腐烂等各种问题，也给农民的经济收入带来巨大的影响。植物对机械伤害的应答是一个非常复杂的过程，长期以来倍受人们的关注，特别是机械伤害信号传导方面一直是研究的热点之一。最近发现PLD（phospholipase D）在各种胁迫因子下发挥重要作用。PLD是一个编码水解生物膜脂的基因家族。在拟南芥中共发现有12种，并且每种都具有各自的生化特性和功能，其中PLDα1和PLDδ在植物体内表达最丰富。研究表明PLDα1和PLDδ可以通过不同的调节机制参与到冻害的应答过程，说明这两种PLD在同一胁迫下可具有不同的作用。已知PLDα1和其代谢产物磷脂酸（PA）参与到机械伤害信号物质茉莉酸（JA）的生物合成过程。而PLDδ在许多胁迫（如干旱、低温和臭氧等）中都发挥着作用，但在机械伤害胁迫中的研究还没有相关报道。因此，本文主要通过遗传修饰技术将拟南芥中PLDδ基因敲除突变体和野生型WS作为对照，从生理、生化和基因表达水平研究了PLDδ在应答机械伤害中的作用，并与PLDα1进行了功能比较分析。其主要结果如下：1、分析膜脂分子组成成分，发现PLD的水解产物PA在机械伤害后含量升高，但PLDδ缺失后的突变体PLDδ—K0内PA增加的量少于野生型WS，说明PLDδ可能参与了机械伤害的应答。总膜脂水平在机械伤害后大幅度下降，而且每种膜脂的变化量各不相同。其中，糖脂是下降量最大的，约占总下降量的90％。通过分析脂肪酸链的成分，发现变化的膜脂主要具有34和36个碳原子，并且34：6 MGDG在突变体和野生型中差异较大（野生型WS，33.636 nmol／mg DW；突变体PLDδ—K0，0.777 nmol／mg DW）。MGDG是类囊体膜上的一种主要结构脂肪，PLDδ促进MGDG的降解势必会导致光合膜功能的下降。Fv／Fm是衡量光合作用常用的一种参数，它代表了PSII的原初转化效率。在本实验中，机械伤害后在含有PLDδ基因的野生型WS中Fv／Fm值下降，从而直接证明了PLDδ能够导致PSII转化效率的下降。2、PLDδ的缺失提高了突变体内MeJA的总含量，尽管变化不是很显著。但它的缺失却导致了突变体系统叶和损伤叶内MeJA含量比例上的改变，即损伤叶内含量较高而系统叶内的含量相对较低，说明了PLDδ影响了主要伤信号物质JAs在体内的运输及其在体内的分布。3、机械伤害能够导致H2O2水平的增加，但PLDα1缺失后植物体内的H2O2水平却没有提高，且低于对照野生型WT，约一倍；然而PLDδ—K0与对应的野生型WS中产生的H2O2变化大致相似。表明PLDα1参与了H2O2的生成过程，而PLDδ可能没有参与这一过程，说明PLDδ和PLDα1在应答机械伤害过程中发挥着不同的作用。DAB组织染色定位H2O2的结果表明机械伤害诱导产生的H2O2先积聚在损伤位点，然后扩散到叶脉，最后到达未损伤叶片全体。说明H2O2可能是通过维管束运输到系统叶内应答机械伤害的。结论：拟南芥中PLDδ参与了机械伤害的应答过程，并且发挥重要的作用。PLDδ对生物膜结构脂类不同程度的降解，可以改变膜脂成分间的比例和膜脂的不饱和度，进而影响了生物膜的组成、性质（如流动性）和功能。PLDδ对主要伤信号物质JAs在植物体内运输和分布的影响，以及另一伤信号物质H2O2可通过维管束系统运输到植物的周身，说明植物遭受机械伤害后，可通过合成和运输伤信号物质到系统叶内而获得系统免疫性，以提高植物的整体防御能力，其中PLDδ可能参与了植物的系统防御应答过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写索引
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.1.1 机械伤害信号传递的研究进展
• 1.1.2 磷脂酶D（PLD）家族
• 1.1.3 PLD参与茉莉酸盐类的生物合成
• 1.2 测定指标
• 1.2.1 膜脂成分的变化和反映生物膜损伤程度的指标
• 1.2.2 反映生物膜功能的指标ˉFv/Fm
• 1.2.3 JA含量测定及相关基因表达水平的检测指标
• 2O₂和ABA的变化指标'>1.2.4 H₂O₂和ABA的变化指标
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 材料,种植与处理
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 拟南芥种植
• 2.1.2.1 土培苗
• 2.1.2.2 水培苗
• 2.1.3 机械伤害的方法
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 脂类的提取（土培苗）
• 2.2.2 丙二醛的测定（水培苗）
• 2.2.3 样品中激素的测定（水培苗）
• 2.2.4 总RNA的提取
• 2.2.5 过氧化氢检测
• 2.2.5.1 过氧化氢含量的测定（土培苗）
• 2.2.5.2 过氧化氢的原位检测（土培苗）
• 2.2.6 Fv/Fm的测定（水培苗）
• 2.2.7 数据分析
• 第三章 实验结果与分析
• 3.1 膜脂的变化
• 3.1.1 总膜脂水平下降,磷脂酸和溶血磷脂却上升
• 3.1.2 膜脂脂肪酸分子成分的变化
• 3.2 茉莉酸甲酯含量的变化
• 3.3 ABA含量的变化
• 2O₂变化'>3.4 H₂O₂变化
• 2O₂含量的变化'>3.4.1 H₂O₂含量的变化
• 2O₂组织化学定位'>3.4.2 H₂O₂组织化学定位
• 3.5 丙二醛含量的变化
• 3.6 Fv/Fm的变化
• 第四章 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究生学习期间的科研成果