论文摘要
猪瘟（Hog cholera,HC或Swine Fever,SF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的猪的一种以高热稽留、小血管变性引起出血、梗死、坏死和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。根据Genbank发表的猪瘟病毒CSFV HCLV-GD株E0序列,设计并合成引物,用逆转录聚合酶链式反应技术扩增CSFV兔化弱毒疫苗株C株的囊膜基因E0,结果获得大小约为700bp的片段。将该片段克隆到PGEM-T-easy载体上进行序列测定,与标准株序列同源性为99.9%。从PGEM-T-E0重组质粒中用BamHI和XhoI双酶切获得测序正确的E0基因片段,克隆入pET32a（+）中,转化BL21感受态细胞。阳性菌酶切鉴定正确后,按1:100比例接种2mL LB液体培养基,过夜培养,再以1:100比例接种2mL 2×YT液体培养基,37℃200rpm摇4 h后,加1.0mM IPTG;37℃诱导5 h后,终止培养,将菌体蛋白超声波裂解处理后进行SDS-PAGE。结果发现,E0能够得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在。降低温度诱导表达的结果表明,当25℃诱导时表达产物呈可溶性。Westen-blot分析结果证明,该表达产物具有反应原性。将E0基因片段与杆状病毒转座载体pFastBac1连接,筛选出重组转座载体pFastBac1-E0,转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后,获得重组穿梭质粒rBacmid-E0;将重组质粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得了含有CSFV HCLV株E0基因的重组杆状病毒rBac-E0。重组病毒感染Sf9细胞后,用E0的原核表达产物免疫小鼠的阳性血清和Western blot方法对真核细胞表达产物进行检测,结果表明:构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达CSFV的E0蛋白,为建立E0单抗荧光筛选筛选方法和E0功能研究奠定了基础。
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