γ射线致人淋巴母细胞及其旁效应细胞FHIT、PTEN表达变化及分子机制的研究

论文摘要

随着核能在国民经济和军事领域中的应用越来越广泛,电离辐射对人类潜在的危害也不断增加。一般认为辐射造成细胞核DNA分子严重损伤,使某些受照体细胞中特定的基因或染色体发生突变,其中涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活或突变、DNA错配损伤修复反应、细胞增殖失控及信号转导通路的改变等因素的综合作用。其机制的研究是电离辐射生物学效应研究的热点和难点之一。值得关注的是,自从国外学者提出电离辐射旁效应概念以来,许多研究者证实旁效应的存在,对“照射细胞核才会引起细胞致命的损伤”“只有受照射细胞才受到损伤”等某些传统观念提出了有力的挑战,辐射诱导的基因不稳定性、细胞质受到照射所致的突变及旁效应等在辐射致癌中同样具有重要作用,并得到放射生物学界的确认。虽然电离辐射旁效应的机制远未了解,但旁效应的发现和研究对于低剂量放射生物效应本质的深入理解及揭示辐射致癌分子机制具有重要的理论意义和实际价值。辐射诱导旁效应（Radiation—induced biologic bystander effect）是指未直接受照射细胞表现出与受照射细胞类似的生物学反应。国内外关于旁效应的研究主要集中在两方面:第一是效应研究,包括细胞凋亡或延迟死亡、基因不稳定性、突变、基因表达改变、炎症反应、微核形成以及细胞生长异常等。第二是旁效应机制研究。现有的资料表明旁效应机制是:（1）活性氧作用:用α粒子照射正常人成纤维细胞,发现细胞间O2-、H2O2的产生,并发现膜上还原酶Ⅱ氧化酶在细胞间ROS增高起重要作用。如用抗氧化剂DMSO处理细胞,发现SCE突变量明显降低。由此可见,电离辐射旁效应引起细胞损伤机制至少部分间接地与ROS有关。（2）细胞因子作用:实验证实,低剂量α粒子照射人成纤维细胞的培养基,引起未照射细胞的增殖,并引起照射细胞的上清液中SOD和TGF-β1的浓度增加。另一实验证实,IL-8作为一种信号分子在辐射旁效应中起重要作用。除此之外,线粒体在氧化应激时分泌的凋亡诱导因子（AIF）也可能与电离辐射旁效应有关系。（3）细胞间缝隙连接通讯:研究者认为,照射细胞数量（细胞密度）是辐射旁效应的主要相关参数。可能由于细胞密度大,细胞缝隙连接通讯发生作用,使许多物质释放到培养基而发生旁效应。另外,电离辐射旁效应的细胞间信号传递涉及到能量代谢,其中ATP产生或NAD/NADP减少,可能是辐射旁效应发生的关键。值得注意的是:对于哪类基因在辐射产生的旁效应中起作用直到目前,辐射旁效应及其机制远未了解。脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad,FHIT）基因是1996年Ohta等用差异显示分析探针和外显子捕获法在染色体3p14.2区域新发现的抑癌基因,全长约1Mb。其cDNA长1095bp,由10个外显子组成,其5’端含有一段长约350bp的非编码区,包含外显子1～3;外显子5～9组成一长约500bp的开放性阅读框架,编码一个由147个氨基酸组成的相对分子质量为16.8×103D的蛋白质。FHIT在生物机体内起广泛的作用,包括①调控细胞周期,②诱导细胞凋亡,③FHIT蛋白水解酶活性,④促进微管组装。10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologuedeleted from chromosome 10,PTEN）是迄今发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,定位在染色体10q23.3上,有9个外显子,编码由403个氨基酸组成的蛋白。PTEN与肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移等生物学特性密切相关,在生物机体内起广泛的作用,包括①调控细胞周期,②诱导细胞凋亡,③调节细胞粘连、迁移和分化。本研究从细胞、基因和蛋白水平对电离辐射细胞及其旁效应细胞FHIT、PTEN表达变化及分子机制进行了初步研究。研究内容1.60Coγ射线照射人淋巴细胞（AHH-1）及与其细胞和培养液共同培养未照射细胞增殖能力的变化、细胞周期的改变和早期凋亡的情况。2.60Coγ射线致AHH-1细胞及与其细胞和培养液共同培养未照射细胞不同时间点FHIT、PTENmRNA及蛋白表达变化的研究。3.氧自由基清除剂二甲基亚砜（DMSO）预处理后,不同剂量60Coγ射线致AHH-1细胞及与其细胞和培养液共同培养未照射细胞在不同时间点FHIT、PTEN蛋白表达变化,以及对细胞增殖、细胞早期凋亡和周期的影响。实验方法1.旁效应细胞模型的制备:正常人淋巴细胞（AHH-1）经0.5、2和5Gy60Coγ射线照射后立即离心,将直接受照细胞与未受照细胞按1:1比例在Transwell中共同培养,另将离心后未过滤的受照细胞培养液与未受照细胞在25cm2培养瓶中共同培养,未经照射组设为对照,细胞处理好后,在37℃、5%CO2条件下细胞培养箱中培养。2.应用细胞计数法观察未受照细胞、受照细胞和旁效应细胞增殖变化,流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡和周期变化。3.应用RT-PCR、Western Blot方法检测未受照细胞、受照细胞和旁效应细胞在照后即刻、6、12、24h抑癌基因FHIT、PTENmRNA及蛋白水平表达情况。4.AHH-1细胞经氧自由基清除剂二甲基亚砜（DMSO）预处理后,按1步骤制备旁效应细胞模型,重复2、3实验,观察细胞经DMSO预处理前后FHIT、PTEN蛋白水平表达情况,以及细胞增殖、凋亡和周期变化情况。5.统计学方法:单样本t检验、单因素方差分析。结果1.直接受照细胞在照射后出现细胞增殖能力下降,早期凋亡增加,细胞增殖出现G2期阻滞,各组旁效应细胞也出现相同的现象,且旁效应细胞早期凋亡与照射剂量无明显相关性。2.与对照组比较,直接受照及旁效应细胞FHIT mRNA表达呈下降,但变化不显著;直接受照及旁效应细胞FHIT蛋白表达均呈下降趋势,吸收剂量为0.5Gy时,其变化不显著;随剂量的增加,FHIT蛋白表达下降越显著,尤其是照射剂量达2.0Gy以上时,FHIT蛋白表达显著下降,存在比较明显的剂量依赖性。直接受照细胞在照射后24小时下调幅度最大,旁效应细胞在照射后12小时下调幅度最大。3.直接受照及旁效应细胞PTEN mRNA表达呈下降趋势,但变化不显著。PTEN蛋白表达下调程度与细胞的处理方式有关,以受照细胞培养液培养的旁效应细胞表达下调最为显著,且高于直接受照细胞。但在处理后12h检测其蛋白表达情况,发现受照细胞共同培养组中0.5Gy旁效应细胞较2Gy旁效应细胞下调明显,与照射剂量无关。该结果目前未见报道。4.经氧自由基清除剂二甲基亚砜（DMSO）预处理后,受照细胞、受照细胞共培养细胞、受照细胞培养液处理细胞较未处理细胞比较,各组细胞PTEN、FHIT蛋白表达均有所上调,且早期凋亡及G2期阻滞情况也有所改变。结论1.受照细胞共培养细胞和受照细胞培养液处理细胞均出现与直接受照细胞相同的增殖能力下降现象,且下降幅度与照射剂量相关及处理条件有关。2.受照细胞、受照细胞共培养细胞和受照细胞培养液处理细胞在处理后24h,细胞早期凋亡均出现增加,直接受照细胞早期凋亡率与照射剂量存在明显的相关性,而旁效应细胞凋亡率与照射剂量相关不显著。3.旁效应细胞组与直接受照细胞组均出现G2期阻滞现象。4.直接受照及旁效应细胞FHIT mRNA表达呈下降趋势,但改变不显著,较高剂量（2.0-5.0Gy）60Coγ射线能导致直接受照细胞FHIT蛋白表达显著下调,且存在剂量依赖关系,照射剂量越大,其下调越显著。旁效应细胞FHIT蛋白表达表现出与直接照射细胞一致的变化趋势,蛋白下调水平幅度在细胞处理后12h最为明显,且受照细胞共培养组下降幅度高于直接照射细胞。该结果目前未见报道。5.直接受照及旁效应细胞PTEN mRNA表达呈下降趋势,但改变不显著,不同剂量受照细胞PTEN蛋白表达呈下调趋势,且存在剂量依赖关系,照射剂量越大,其下调越显著。不同剂量旁效应细胞PTEN蛋白表达也表现出下调趋势,在细胞处理后12h最为明显,下调程度与细胞的处理方式有关,以受照细胞培养液培养的旁效应细胞表达下调最为显著,但受照细胞共同培养组中0.5Gy旁效应细胞较2Gy旁效应细胞下调明显,分析抑癌基因PTEN在低剂量（0.5Gy）照射时较敏感。该结果目前未见报道。6.AHH-1细胞经氧自由基清除剂DMSO处理后,再经上述条件处理,并与上述结果比较,分析氧自由基清除剂对受照细胞有一定的保护作用,可以使抑癌基因FHIT、PTEN受损减少,使其维持正常生理功能,发挥作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 论文
• 短篇论著
• 文章发表情况
• 致谢