VCAM-1胞外区蛋白D1-D4结构域蛋白原核和真核表达

论文摘要

血管细胞粘附分子-1（VCAM-1,又名CD106）是一种非常重要的细胞粘附分子,属于免疫球蛋白超家族（IGSF）成员。VCAM-1胞外区蛋白有7个结构域（分子量为110 kD）,其中结构域1（D1）和结构域4（D4）是VCAM-1与其配体VLA-4特异性结合作用部位。VCAM-1与其配体VLA-4相互作用,并参与许多种不同的生理现象,如调节炎症反应、参与免疫应答、促使淋巴细胞的归巢以及再循环、参与细胞和组织的分化、发育还有参与肿瘤的扩散、转移等。在体外表达具有生物活性的VCAM-1 D1-D4结构域将有助于深入研究VCAM-1的生物学功能。本研究通过从小鼠的成纤维细胞（NIH/3T3）提取总RNA,以其为模板通过RT-PCR扩增VCAM-1 cDNA。利用PCR获得VCAM-1胞外区D1-D4基因,连接pMD19-T载体,进行基因序列测序。测序结果显示目的片段序列正确,无突变。将VCAM-1胞外区域目的片段分别插入到原核表达载体pET28a和真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc中,构建重组原核表达质粒pET28a-VCAM-1 D1-D4以及真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1 D1-D4。双酶切鉴定重组的 pET28a-VCAM-1 D1-D4 质粒和pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1 D1-D4质粒成功构建。将原核表达质粒pET28a-VCAM-1 D1-D4转化大肠杆菌BL21并由IPTG诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测显示诱导表达的目的蛋白高表达。利用脂质体梭华-Sofast把pIRE S2-AcGFP 1-Nuc-VC AM-1 D1-D4 导入至人 B 淋巴性白血病细胞株（Raji）内,Western blot检测实验显示导入pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1 D1-D4质粒的Raji细胞中VCAM-1 D1-D4高表达。VCAM-1 D1-D4结构域蛋白的成功表达为研究VLA-4/VCAM-1相互作用提供实验基础,也为进一步研究前B细胞分化发育提供实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 细胞粘附分子家族
• 1.2 VCAM-1基因
• 1.3 VCAM-1蛋白结构
• 1.4 VCAM-1蛋白表达
• 1.5 VCAM-1的生物学功能
• 1.5.1 调节炎症反应
• 1.5.2 参与免疫应答反应
• 1.5.3 参与淋巴细胞的归巢和再循环
• 1.6 小结
• 2 血管内皮细胞粘附分子VCAM-1胞外区D1-D4蛋白原核表达
• 2.1 前言
• 2.2 仪器与材料
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 材料与试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 复苏小鼠成纤维细胞（NIH/3T3）
• 2.3.2 小鼠成纤维细胞（NIH/3T3）中提取总RNA
• 2.3.3 RNA浓度测定及检测
• 2.3.4 RT-PCR扩增VCAM-1基因
• 2.3.5 PCR扩增VCAM-1胞外区基因
• 2.3.6 PCR产物与T载体连接
• 2.3.7 提取质粒pMD19-T-VCAM-1送宝生物测序
• 2.3.8 重组质粒pET28a-VCAM-1构建与鉴定
• 2.3.9 pET28a-VCAM-1转化大肠杆菌BL21并由IPTG诱导表达
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 RT-PCR扩增VCAM-1 D1-D4结构域基因
• 2.4.2 PCR鉴定重组质粒pMD19-T-VCAM-1 D1-D4连接
• 2.4.3 VCAM-1 D1-D4结构域基因测序
• 2.4.4 重组pET28a-VCAM-1 D1-D4载体的构建以及鉴定
• 2.4.5 pET28a-VCAM-1 D1-D4诱导表达
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 3 血管内皮细胞粘附分子VCAM-1胞外区D1-D4蛋白真核表达
• 3.1 前言
• 3.2 仪器与材料
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 材料与试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 提取质粒pMD19-T-VCAM-1 D1-D4双酶切鉴定
• 3.3.2 pMD19-T-VCAM-1 D1-D4质粒与表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc双酶切
• 3.3.3 VCAM-1 D1-D4与真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc连接
• 3.3.4 质粒转化至大肠杆菌DH5α
• 3.3.5 PCR鉴定
• 3.3.6 重组质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1 D1-D4双酶切鉴定
• 3.3.7 脂质体转染
• 3.3.8 G418筛选
• 3.3.9 细胞总蛋白提取并SDS-PAGE电泳检测
• 3.3.10 VCAM-1 D1-D4结构域蛋白纯化
• 3.3.11 Western blot
• 3.3.12 共聚焦观察pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒成功转染Raji细胞
• 3.3.13 显微镜观察转染前后细胞形态变化
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 提取质粒pMD19-T-VCAM-1 D1-D4双酶切鉴定
• 3.4.2 PCR鉴定重组质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1 D1-D4连接成功
• 3.4.3 重组质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1 D1-D4双酶切鉴定
• 3.4.4 细胞转染与G418筛选
• 3.4.5 共聚焦检测pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒成功转染Raji细胞
• 3.4.6 重组pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1 D1-D4真核表达
• 3.4.7 Western blot检测目的蛋白VCAM-1 D1-D4
• 3.4.8 显微镜观察pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒转染Raji细胞形态变化
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 结论
• 参考文献