山羊角膜上皮细胞与角膜内皮细胞分离培养研究

论文摘要

各种角膜疾病和外科损伤都会导致角膜细胞受损,当损伤超过其生理代偿时,就会发生角膜病变,严重时会导致角膜盲。目前角膜移植是治疗此类角膜疾病比较成熟的方法,但受到了供体角膜缺乏、术后并发症、角膜供体老龄化等条件的限制。将自体或异体角膜细胞体外培养构建组织工程化人工角膜移植,既可解决临床应用供体短缺问题,又可为角膜体外药理或生理研究提供大量材料。本研究通过体外分离培养山羊角膜上皮细胞和角膜内皮细胞,并研究其体外生长特性和接种羊膜载体培养情况,为组织工程人工角膜的构建奠定理论基础。1.山羊角膜上皮细胞的体外分离培养与鉴定通过比较组织块和酶消化法培养山羊原代角膜缘上皮细胞,发现酶消化法更适合原代角膜缘上皮细胞的分离纯化培养。获取的山羊角膜缘上皮细胞形态为多角形,具有较强的增殖能力,体外培养能传20多代,细胞冻存后仍具有细胞冻存前的形态和活力。经免疫组化和RT-PCR检测,培养的角膜缘上皮细胞表达K3/K12、p63、Cx43、ABCG2和PCNA,具有角膜上皮细胞和角膜缘干细胞表型,说明分离培养的细胞为角膜缘上皮细胞和角膜缘干细胞混合物,可为组织工程化人工角膜上皮的构建提供种子细胞。2.组织工程化人工角膜上皮的构建在去上皮细胞人羊膜上接种关中奶山羊角膜缘组织块或培养的关中奶山羊角膜缘上皮细胞构建的组织工程角膜上皮,并对其进行组织形态学、超微结构观察和免疫组化检测。结果显示,角膜缘组织块和角膜上皮细胞在羊膜上培养15 d均可形成6～7层结构,细胞内含丰富的细胞器和糖原颗粒,细胞间有大量的桥粒连接,细胞与羊膜间形成半桥粒连接,构建的复合角膜上皮p63染色阳性。比较角膜缘组织块在去羊膜上皮细胞的新鲜羊膜、冻存30 d羊膜、冻存60 d羊膜和冻存180 d羊膜上生长情况发现,从角膜缘组织块脱出的细胞生长面积在冻存30 d羊膜上最大,而在新鲜羊膜上细胞生长面积最小。比较角膜缘组织块在冻存60 d去上皮羊膜和未去上皮羊膜上生长情况发现,从角膜缘组织块脱出的细胞生长面积在去上皮羊膜上显著大于未去上皮羊膜上。说明用组织块法和种传代细胞法均能构建组织工程化人工角膜上皮,细胞培养载体需用冻存30 d左右去上皮细胞的羊膜,为组织工程化人工角膜上皮的构建研究奠定理论基础。3.山羊角膜内皮细胞的体外分离培养与鉴定比较组织块法、胰酶消化法、dispase酶消化法和dispase酶+胰酶消化法培养山羊原代角膜内皮细胞。dispase酶+胰酶消化法为角膜内皮细胞原代分离纯化的最适方法,分离的细胞在体外能连续传20多代,细胞冻存后解冻培养能保持冻存前细胞形态和活力。培养的细胞经扫描电镜和透射电镜观察,具有正常角膜内皮细胞特征,免疫组化染色和RT-PCR检测角膜内皮细胞表达神经元标志NSE和β3-tublin、星形胶质细胞标志GFAP、细胞间连接蛋白ZO-1和Cx43,不表达神经干细胞标志物Nestin、角膜缘干细胞标志p63和角膜上皮细胞标志K3/K12。比较细胞培养板包被物对角膜内皮细胞贴壁和增殖能力影响发现,Ⅳ胶原、多聚赖氨酸和明胶均能明显促进细胞贴壁和增殖,Ⅳ胶原和明胶组强于多聚赖氨酸组,而Ⅳ胶原组和明胶组之间差异不显著,提示可选择价格便宜的明胶作为细胞培养板用包被物。角膜内皮细胞培养液筛选发现:与NBS相比,FBS能更好的促进角膜内皮细胞增殖和维持其形态;培养液中添加bFGF能显著促进细胞增殖,但能促进细胞形态向成纤维形转变;添加EGF对细胞增殖影响不大,但能促进细胞形态改变;添加硫酸软骨素显著抑制细胞增殖,但能较好的维持细胞形态;添加Vc对细胞增殖和形态均无明显影响。将传代培养的角膜内皮细胞种羊膜上培养,经组织切片、透射和扫描电镜观察发现细胞在羊膜上具有形成单层的能力。说明分离培养的角膜内皮细胞具有正常角膜内皮细胞特征,能体外传代培养,在羊膜载体上具有形成单层的能力,可为构建组织工程化人工角膜内皮和角膜内皮细胞的体外实验研究提供种子细胞。4.山羊角膜内皮细胞人端粒酶逆转录酶基因转染将人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）转入培养至7代的角膜内皮细胞内,通过免疫组化和RT-PCR检测证明转染的hTERT在山羊角膜内皮细胞内表达。通过传代培养观察,转染hTERT的角膜内皮细胞体外能传20多代,与未转染hTERT的角膜内皮细胞相比,并未显著提高其增殖能力。说明将人端粒酶基因转入山羊角膜内皮细胞内,未能明显延长细胞寿命。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 角膜的早期胚胎发育、组织结构和生理功能
• 1.1 角膜的早期胚胎发育
• 1.1.1 胚眼的形成
• 1.1.2 角膜的发生与形成
• 1.1.3 角膜内皮的胚胎发育
• 1.2 角膜的解剖结构
• 1.3 角膜的组织结构
• 1.3.1 上皮细胞层
• 1.3.2 前弹力膜
• 1.3.3 基质层
• 1.3.4 后弹力膜
• 1.3.5 内皮细胞层
• 1.4 角膜缘
• 1.5 角膜的生理功能
• 1.5.1 角膜的透明性
• 1.5.2 角膜的渗透性
• 1.5.3 角膜的生理免疫功能
• 1.5.4 角膜的营养和代谢
• 1.5.5 角膜的修复
• 1.5.6 角膜的知觉
• 第二章 角膜缘干细胞
• 2.1 角膜缘干细胞的概念与定位
• 2.1.1 干细胞的概念和特点
• 2.1.2 角膜缘干细胞及其定位
• 2.2 角膜缘干细胞的微环境
• 2.3 角膜缘干细胞的特异性标记
• 2.4 角膜缘干细胞体外培养
• 2.4.1 角膜缘干细胞的分离培养方法
• 2.4.2 角膜缘干细胞的培养条件
• 2.4.3 体外培养的角膜缘干细胞鉴定方法
• 2.5 角膜缘干细胞的临床应用
• 2.5.1 自体角膜缘干细胞的移植
• 2.5.2 异体角膜缘干细胞移植
• 2.5.3 角膜缘干细胞体外培养后移植
• 第三章 人羊膜在眼科临床应用的研究进展
• 3.1 羊膜的生物学特性
• 3.2 人羊膜的制备与保存
• 3.2.1 羊膜的制备
• 3.2.2 羊膜的保存
• 3.3 羊膜在眼科领域的应用
• 3.3.1 羊膜在各种眼表疾病治疗中的应用
• 3.3.2 作为药物缓释系统
• 3.4 问题与展望
• 第四章 角膜内皮细胞研究进展
• 4.1 角膜内皮细胞的增殖能力
• 4.1.1 角膜内皮细胞的结构和功能
• 4.1.2 角膜内皮细胞体内不增殖的证据
• 4.1.3 体内抑制角膜内皮细胞增殖的机制
• 4.1.4 细胞周期与角膜内皮细胞增殖
• 4.1.5 年龄与角膜内皮细胞增殖
• 4.1.6 促进角膜内皮细胞增殖的因素
• 4.2 角膜内皮细胞干细胞
• 4.3 角膜内皮细胞的体外培养
• 4.3.1 角膜内皮细胞的分离培养研究
• 4.3.2 角膜内皮细胞的鉴定
• 4.4 培养的角膜内皮细胞移植
• 第五章 组织工程化人工角膜的研究
• 5.1 人工角膜的研究简史
• 5.2 组织工程化人工角膜的构建
• 5.2.1 种子细胞
• 5.2.2 载体研究
• 5.2.3 组织工程全层角膜的构建及移植
• 第六章 山羊角膜缘上皮细胞的体外分离培养与鉴定
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 体外培养的角膜缘上皮细胞的生长特性
• 6.2.2 生长曲线及群体倍增时间
• 6.2.3 贴壁率
• 6.2.4 角膜缘上皮细胞的冻存与复苏
• 6.2.5 免疫组化染色
• 6.2.6 RT-PCR 检测结果
• 6.3 讨论
• 6.3.1 山羊角膜缘上皮细胞生长特性
• 6.3.2 角膜缘干细胞的鉴定
• 6.4 小结
• 第七章 组织工程化人工角膜上皮的构建
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 羊膜的制备与保存
• 7.1.3 角膜缘上皮细胞的培养
• 7.1.4 羊膜角膜上皮植片的构建
• 7.1.5 不同冻存时间羊膜对角膜缘上皮细胞培养的影响
• 7.1.6 羊膜上皮细胞对角膜缘上皮细胞生长的影响
• 7.1.7 正常山羊角膜的采集
• 7.1.8 石蜡切片的制备和HE 染色
• 7.1.9 免疫组化染色观察
• 7.1.10 透射电镜观察
• 7.1.11 数据统计
• 7.2 结果
• 7.2.1 组织工程人工角膜的构建
• 7.2.2 不同冻存时间羊膜对角膜缘上皮细胞生长的影响
• 7.2.3 羊膜上皮细胞对角膜缘上皮细胞生长的影响
• 7.3 讨论
• 7.3.1 组织工程人工角膜的构建
• 7.3.2 冻存不同时间去上皮羊膜对角膜缘上皮细胞的影响
• 7.3.3 羊膜上皮细胞对角膜缘上皮细胞生长的影响
• 7.4 小结
• 第八章 山羊角膜内皮细胞的分离培养与鉴定
• 8.1 材料和方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 方法
• 8.2 结果
• 8.2.1 GCECs 培养方法的比较
• 8.2.2 GCECs 生长特性
• 8.2.3 培养体系筛选
• 8.2.4 GCECs 的鉴定
• 8.2.5 GCECs 在羊膜上的培养
• 8.3 讨论
• 8.3.1 角膜内皮细胞分离纯化与鉴定
• 8.3.2 角膜内皮细胞的生长特性
• 8.3.3 培养体系筛选
• 8.4 小结
• 第九章 山羊角膜内皮细胞人端粒酶逆转录酶基因转染
• 9.1 材料与方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 方法
• 9.2 结果
• 9.2.1 pC1-neo-hTERTT 质粒双酶切鉴定
• 9.2.2 RT-PCR 检测细胞中外源性hTERT 的表达
• 9.2.3 免疫组化染色结果
• 9.2.4 细胞形态观察
• 9.2.5 细胞生长曲线
• 9.3 讨论
• 9.4 小结
• 结论
• 本研究的创新之处和尚需进一步研究的课题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介