北方防护林树种毛白杨抗虫基因遗传转化及其安全性评价

论文摘要

毛白杨是我国北方一个常用的防护林树种,其特点是干形通直、材质好、生长快,但是也存在叶部虫害教严重、雌株春季飞絮等问题。本文利用败育毛白杨雄株-D为主要材料,在研究其雄性不育机制的基础上,利用转基因技术培育出抗虫新品种,并对环境安全等方面进行了评价。主要研究成果如下:1、2004～2007年对败育毛白杨雄株-D花药外部形态及花药发育过程进行了观察研究。连续四年的花枝室内水培实验,均未发现花粉散出。花药发育的细胞组织学研究发现,花药后期干瘪不开裂、绒毡层解体延迟、大部分小孢子发育异常不能形成正常的花粉粒。2、以败育毛白杨雄株-D去叶带芽茎段作为外植体,建立了其植株再生体系。采用组培苗叶片为外植体,建立了适合遗传操作的败育毛白杨雄株-D叶片再生体系。3、通过抗生素临界浓度筛选实验,确定了卡那霉素的临界浓度为50mg/L。4、通过农杆菌介导法将含有不同杀虫机制的Bt和API-A（重组质粒为pBtiA,农杆菌为LBA4404）转入败育毛白杨雄株-D。获得21株卡那霉素抗性植株。抗性植株的Bt和API-A基因PCR检测阳性率为90%。5、对PCR检测阳性植株进行了抗虫生物检测。转基因败育毛白杨雄株-D对杨扇舟蛾和舞毒蛾幼虫具有明显的毒杀特性。筛选并获得4个高抗株系（编号为D-84、D-87、D-94、D-95）、3个中抗株系（编号为D-74、D-85、D-88）。各转基因株系（高抗株系和中抗株系系）对靶试昆虫的生长发育有明显抑制作用。生物测定的结果进一步证实了外源抗虫基因在植物基因组的整合和正常表达。其中D-84、D-88和D-95植物基因组中Bt基因的Southern杂交检测阳性。6、为探讨转基因杨树的环境风险,对已批准环境释放的转基因741杨根部微生物进行了较为详细的研究。转基因741杨根部细菌的种类均高于对照未转基因741杨。转基因741杨根部真菌种类均低于对照为转基因741杨。7、对从转基因741杨栽培地土壤中分离得到的860株次细菌（有重复）和120株次真菌（有重复）的总DNA进行PCR检测,在所有的被检测的细菌和真菌总DNA中均为发现Bt（含有35S启动子片段）以及NPTII基因片段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略词表
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 毛白杨花粉败育和雄性不育研究现状
• 1.3 杨树抗虫基因工程育种研究进展
• 1.3.1 抗虫基因类型以及遗传转化机制
• 1.3.2 杨树抗虫基因转化的研究
• 1.3.3 杨树抗虫基因工程育种中存在的问题
• 1.4 转基因植物的安全性
• 1.4.1 转基因植物可能成为超级杂草
• 1.4.2 抗虫转基因植物带来的潜在危险
• 1.4.3 转基因植物对环境的影响
• 1.4.4 转基因植物对人类社会的影响
• 1.4.5 转基因植物安全性评价的重要性
• 2 败育毛白杨雄株-D 花粉发育的细胞组织学研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 研究方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 花药发育形态学观察
• 2.2.2 花药壁和花粉的形成和发育
• 2.3 小结
• 3 败育毛白杨雄株-D 再生体系的建立
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 研究方法
• 3.2 实验结果
• 2溶液对败育毛白杨雄株-D 外植体体表灭菌效果研究'>3.2.1 1% HgCl₂溶液对败育毛白杨雄株-D 外植体体表灭菌效果研究
• 3.2.2 外植体不定芽诱导研究
• 3.2.3 继代和生根诱导培养研究
• 3.3 小结
• 4 败育毛白杨雄株-D双抗虫基因转化的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 研究方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 败育毛白杨雄株-D 叶片再生体系的建立
• 4.2.2 影响遗传转化因素研究
• 4.2.3 转化芽的获得与筛选
• 4.2.4 转基败育毛白杨雄株-D的移栽
• 4.2.5 转基因败育毛白杨雄株-D的分子生物学检测
• 4.3 小结
• 5 转基因败育毛白杨雄株-D的抗虫性研究
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 测试昆虫
• 5.1.3 研究方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 各转基因无性系对杨扇舟蛾和舞毒蛾幼虫死亡率的影响
• 5.2.2 抗虫无性系对不同龄期杨扇舟蛾幼虫死亡率的影响
• 5.2.3 抗虫无性系对杨扇舟蛾幼虫发育进度的影响
• 5.2.4 抗虫无性系对杨扇舟蛾幼虫体重增长速率的影响
• 5.3 小结
• 6 转基因741杨对土壤微生物影响的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料与培养基
• 6.1.2 实验方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 转基因741杨根际微生物的季节动态变化及其分布规律的研究
• 6.2.2 转基因741杨外缘基因与土壤微生物间基因转移研究
• 6.3 小结
• 7 结论与讨论
• 7.1 主要结论
• 7.2 讨论
• 参考文献
• 附图
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢