湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病活性与物质基础研究

论文摘要

湖北麦冬（Liriope spicata （Thunb.） Lour. var. prolifera Y. T. Ma）是湖北省的道地药材,是中药麦冬的主流品种之一。在中医临床上湖北麦冬与杭麦冬和川麦冬等同入药,用于治疗热病伤津、心烦口渴等症。在古今治疗糖尿病（消渴病）的中药复方中麦冬常作为主药,近年多位学者就麦冬的“消渴”作用做了一些抗糖尿病研究,表明川、杭麦冬具有抗糖尿病的作用,并初步证明其发挥抗糖尿病作用的活性物质主要是麦冬多糖。对湖北麦冬多糖降血糖的相关研究在国内外还未见公开报道,但湖北麦冬多糖极可能也具有降血糖活性。鉴于此,在国家自然科学基金和国家十一五科技支撑计划的资助下,本论文对湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病活性、活性物质（湖北麦冬多糖）的制备工艺、理化性质及结构特征进行了研究。本论文由四个部分组成。第一部分为湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病的活性及作用机理研究,证实湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病活性,确定其活性物质基础为多糖成分,并推测改善胰岛素抵抗是其抗Ⅱ型糖尿病机理之一。第二部分为湖北麦冬多糖（TLSP）制备工艺研究,确定出一条稳定、天然、高效的湖北麦冬多糖实验室制备路线。第三部分是湖北麦冬多糖（TLSP）的理化性质及结构研究,获得了TLSP及从中分离出的均一多糖（LSP1和LSP2）稳定的理化参数,并解析出LSP1和LSP2的一级结构特征。第四部分是综述,对2005年1月至2010年12月报道的具有潜在抗糖尿病活性的单体化合物进行了概括。第一部分为探究湖北麦冬是否具有抗糖尿病（Ⅱ型糖尿病）活性、活性物质是什么,本研究首先采用高脂高糖饲料+小剂量STZ诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠模型,对湖北麦冬抗糖尿病活性成分提取溶剂（95%乙醇或水）进行筛选研究,确定只有水提取物（WE）具有较强的抗糖尿病活性（降低糖尿病小鼠的空腹血糖（P<0.01）,改善糖尿病小鼠糖耐量（P<0.01））。接着,本研究对湖北麦冬水提取物（WE）进行分离、纯化,得到湖北麦冬粗多糖（CP）、总多糖（TLSP）及无糖部位（NP）,并采用同样的动物模型对各部位进行活性筛选,确定WE、CP、TLSP均具有较强的抗糖尿病活性（降血糖及改善糖耐量,P<0.01）,活性强度依次为WE<CP<TLSP,非糖部位（NP）无抗糖尿病活性。多糖纯度最高的TLSP具有最好的活性,说明TLSP是湖北麦冬主要的抗糖尿病活性成分。为进一步探讨湖北麦冬多糖的抗Ⅱ型糖尿病活性物质基础,本研究又对TLSP进行分离纯化,得到均一多糖1（LSP1）和2（LSP2）,并采用同样的动物模型对TLSP、LSP1和LSP2进行活性比较。实验结果证实,TLSP、LSP1和LSP2均可显著降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖（P<0.01）,改善糖耐量（P<0.01）和降低胰岛素抵抗指数（P<0.01）,各项作用强度与罗格列酮比较没有显著性差异（P>0.05）。而且能降低血总胆固醇（P<0.01）和甘油三酯（P<0.01）、增加高密度脂蛋白相对含量（P<0.01）并降低低密度脂蛋白水平（P<0.01）,其效果均较罗格列酮好（P<0.05或P<0.01）,体现湖北麦冬多糖能从多方面综合治疗糖尿病、缓解其症状。通过各方面综合比较,确定三者抗Ⅱ型糖尿病活性强度基本相当：TLSP≈LSP1≈LSP2,100mg/kg≈200mg/kg。由于TLSP的制备工艺相对简单,工业生产周期短、成本低。因此本项目组选择TLSP为候选药物进行后续开发,并初步确定其对小鼠的有效剂量为100mg/kg。同时,在对TLSP、LSP1和LSP2的药效学研究中,发现TLSP、LSP1和LSP2均具有改善胰岛素抵抗（HOMA-IR）的作用,因此,本课题顺着胰岛素抵抗这条路线,研究湖北麦冬多糖对改善胰岛素信号转导通路和肝糖代谢的影响,以初步探究抗Ⅱ型糖尿病机理。机理研究结果表明,TLSP、LSP1和LSP2均能明显提高糖尿病小鼠肾脏组织中胰岛素信号因子—胰岛素受体（InsR）、胰岛素受体底物-1（IRS-1）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的表达水平（P<0.01）,进而改善胰岛素信号传导,增加组织对胰岛素的敏感性,从而改善糖尿病症状,这是湖北麦冬多糖抗糖尿病机理之一。同时,TLSP、LSP1和LSP2还能增加肝糖原含量（P<0.01）及葡萄糖激酶（GcK）活性（P<0.01）,降低葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）活性（P<0.01）,从而改善糖尿病小鼠肝内糖代谢紊乱,增强肝细胞合成糖原及促进葡萄糖利用,进而改善糖尿病症状,这是湖北麦冬多糖抗糖尿病机理之二。第二部分在确定以湖北麦冬多糖TLSP作为抗糖尿病候选药物开发后,本研究分别采用正交和单因素实验对TLSP的沸水提取、酶解除蛋白质、透析除小分子、醇沉及DEAE-纤维素柱层析脱色工艺进行优化。经反复验证,得到一条稳定的TLSP制备路线。确定出的制备路线为：取湖北麦冬干燥块根的粗粉,煎煮3次,每次加入水的体积分别为粗粉重量的4、4和2倍,每次30分钟,合并滤液,60℃减压浓缩得到6倍药材体积粗多糖液；将粗多糖液调节pH 6和水浴温度45℃,加入0.3%药材量的木瓜蛋白酶（12U/mg）,酶解2小时,将酶解后的多糖液煮沸5 min,静置放冷,抽滤去沉淀。然后将滤液装入透析袋（Mw1000）（装入的液体量不超过透析袋容积的2/3）用自来水和蒸馏水各透析1天,去除小分子。透析后的袋内多糖液（保留部分）缩到原药材重量的1.5倍体积,加入95%的乙醇,以乙醇终浓度80%在室温下（20±2℃）醇沉24h,收集沉淀；上清液减压浓缩到原药材重量的1.0倍体积,再加入95%的乙醇,以乙醇终浓度80%在室温下（20±2℃）再醇沉24h,收集沉淀；合并沉淀部分,真空／冷冻干燥获得湖北麦冬粗多糖。湖北麦冬粗多糖蒸馏水溶解、调节浓度0.2g/mL,采用DEAE-纤维素52层析柱脱色纯化,上样体积5mL/g填料,上样及洗脱流速2.5柱体积/h（BV/h）,蒸馏水／纯水为洗脱剂,水洗量3 BV,收集量6 BV（从上样后第2 BV的下柱液开始收集）。收集到的多糖液减压浓缩、真空／冷冻干燥即得湖北麦冬多糖TLSP。第三部分为了更好的对湖北麦冬多糖（TLSP）进行质量控制,本论文对TLSP的理化性质及其主要的组成成分（LSP1和LSP2）的一级结构特征进行研究。主要结果如下：（1）从TLSP中分离得到2个结构新颖的均一多糖,LSP1和LSP2,两均一多糖分别占TLSP的25.4%和64.2%。（2）运用多种物理、化学方法对TLSP、LSP1和LSP2的常规理化性质进行了研究,获得了TLSP、LSP1和LSP2稳定的理化参数。（3）运用多种光谱、色谱、化学等方法对LSP1和LSP2的一级结构进行研究,获得LSP1和LSP2较精确的结构信息。LSP1为小分子果聚糖（Mw为3199）,聚合度为20,由19个β-D-果糖和1个α-D-葡萄糖构成；其主链是以1、2链接的果糖残基构成,有6个重复单元,每个单元包含1个1、2位连接的双取代果糖残基、1个1、2、6位连接的三取代果糖残基和1个2位连接的单取代果糖残基；多糖主链的一个末端以2位羟基与1个α-D-葡萄糖的1位羟基链接成苷,另一个末端以1位羟基与1个β-D-果糖的2位羟基链接成苷。LSP2也为小分子果聚糖（Mw为4287）,聚合度为26,由25个β-D-果糖和1个α-D-葡萄糖构成；其主链是以1、2链接的果糖残基构成,有6个重复单元,每个单元包含2个1、2位连接的双取代果糖残基、1个1、2、6位连接的三取代果糖残基和1个2位连接的单取代果糖残基；多糖主链的一个末端以2位羟基与1个α-D-葡萄糖的1位羟基链接成苷,另一个末端以1位羟基与1个β-D-果糖的2位羟基链接成苷。第四部分本部分对2005年1月至2010年12月报道的具有抗糖尿病潜力的单体化合物进行了概括,侧重于介绍从药用植物分离获得的一些具有抗糖尿病活性的化合物（包括已知的和新发现的）,包括皂甙、黄酮、生物碱、蒽醌类、萜类、香豆素类、酚类、多糖和其他一些化合物,以说明抗糖尿病天然产物研究的必要性。

论文目录

• 英文缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病的活性及作用机理研究
• 1 动物、仪器与材料
• 2 方法与步骤
• 2.1 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的选择与建立
• 2.2 湖北麦冬抗糖尿病活性成分提取溶剂的选择
• 2.3 湖北麦冬抗糖尿病活性部位的筛选
• 2.4 湖北麦冬多糖TLSP、LSP1和LSP2抗Ⅱ型糖尿病药效学研究
• 2.5 湖北麦冬多糖TLSP、LSP1和LSP2抗Ⅱ型糖尿病作用机理研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 湖北麦冬抗糖尿病活性成分的提取溶剂
• 3.2 湖北麦冬水溶性各部位的抗糖尿病活性
• 3.3 湖北麦冬多糖TLSP、LSP1和LSP2对Ⅱ型糖尿病的治疗效果
• 3.4 湖北麦冬多糖TLSP、LSP1和LSP2抗Ⅱ型糖尿病的作用机理
• 4 本章小结
• 4.1 湖北麦冬抗Ⅱ型糖尿病的活性物质基础
• 4.2 湖北麦冬多糖抗Ⅱ型糖尿病作用机理和靶点
• 第二章 湖北麦冬多糖（TLSP）的制备工艺研究
• 1 材料与仪器
• 2 方法与步骤
• 2.1 湖北麦冬多糖含量测定方法的建立
• 2.2 提取工艺的优化
• 2.3 酶解除蛋白工艺的优化
• 2.4 透析除小分子工艺的优化
• 2.5 醇沉工艺的优化
• 2.6 DEAE-纤维素52脱色工艺的优化
• 2.7 湖北麦冬多糖（TLSP）制备工艺的验证
• 3 结果与讨论
• 3.1 湖北麦冬多糖含量测定方法
• 3.2 提取工艺
• 3.3 酶解除蛋白工艺
• 3.4 透析除小分子工艺
• 3.5 醇沉工艺
• 3.6 DEAE-纤维素52层析脱色工艺
• 3.7 湖北麦冬多糖（TLSP）制备工艺的验证
• 4 本章小结
• 第三章 湖北麦冬多糖（TLSP）的理化性质及结构研究
• 1 材料与仪器
• 2 方法与步骤
• 2.1 TLSP的主要组成成分LSP1和LSP2的制备
• 2.2 TLSP、LSP1和LSP2的常规理化性质研究
• 2.3 LSP1的结构解析
• 2.4 LSP2的结构解析
• 3 结果与讨论
• 3.1 TLSP、LSP1和LSP2的常规理化性质
• 3.2 LSP1的结构特征
• 3.3 LSP2的结构特征
• 4 本章小结
• 第四章 全文总结、讨论及展望
• 1 研究成果总结
• 2 特色与创新
• 3 需要深入探讨的内容
• 参考文献
• 第五章 综述
• 参考文献
• 致谢
• 附录