靶向HBV的高效siRNA的筛选及体内、外抗病毒研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界最重要的公共卫生问题之一,严重危害人类健康。尽管预防疫苗免疫降低了乙肝发生率,但目前全世界仍有约4亿HBV感染者,当前的药物治疗方法尚不足于应对该挑战,因此迫切需要发展新的更为有效的治疗手段以对付HBV的威胁。RNAi是近年来发现的细胞内序列特异性抑制基因表达的机制,将RNAi技术应用于包括病毒性肝炎等在内的疾病治疗已成为当前的研究热点,而获得兼具高效抑制特性和保守性特征的RNAi靶位是RNAi治疗方法获得成功应用的重要基础。本研究以生物信息学为辅助,通过建立多基因型HBV细胞和小动物表达模型,对HBV基因组上潜在的siRNA靶点进行了规模化筛选和验证,获得多个具有良好应用潜力的siRNA靶点,为进一步应用RNAi技术开发新型乙肝治疗方法提供重要基础。本研究首先通过Genbank数据库获得623个已报道的HBV全基因组序列,应用GCG生物信息学工作站对其进行全基因组的序列保守性分析,获得同源性为95%以上的高保守序列区段。采用步移法设计可靶向上述高保守序列区段的siRNA,并通过RNAi脱靶效应分析软件进行分析,初筛获得40个可识别不同位点并具有高保守特征的候选siRNA靶点序列,并以pSUPER为载体分别构建了相应的shRNA表达质粒,用于进行进一步的筛选实验。本研究采用与HBV 1.3倍体克隆质粒的共转染实验检测不同siRNA对HBV的抑制效率。应用本实验室构建的5个分属C1、D1、Ae基因型的HBV 1.3倍体克隆在Huh-7细胞中建立了体外HBV瞬时表达模型,结果显示其均可有效在Huh-7细胞中表达HBV重要标志性抗原HBsAg与HBeAg。同时通过对检测时间点与共转染质粒用量配比的比较分析,确定了较有利于筛选高效靶点的检测条件。在此基础上,将本研究构建的40个包含候选siRNA表达元件的质粒克隆分别与上述HBV 1.3倍体克隆以1:10的用量比例对Huh-7细胞进行共转染实验,检测不同靶点siRNA对HBV蛋白表达的抑制能力。结果显示,本研究选择设计的40个siRNA可在不同程度上抑制HBV的表达,其中部分靶点的siRNA体现出良好的抑制效果（部分靶点已申请发明专利,申请号:200810110686.4）。本研究选择了其中3个抑制效率较好的siRNA靶点（B244、B245、B376）用于进一步的研究和验证。通过CCK8检测细胞毒性与细胞活力,和干扰素相关基因STAT-1及OSA-1表达水平检测显示上述3个靶点siRNA在细胞中的表达不会引起的细胞活性及干扰素相关基因基因转录水平的异常变化,显示其无脱靶效应。RNAi技术应用于抗病毒治疗研究中另一重要方面是如何有效地将siRNA或siRNA表达元件导入靶细胞中。应用HBV表达细胞株HepG2-N10,本研究探讨了通过重组慢病毒载体和化学修饰siRNA的方式导入siRNA抑制HBV表达的可行性。本研究分别构建了可表达靶向B1579、B1881、B2391、B2393的siRNA的重组慢病毒,转导HBV表达细胞株HepG2-N10后检测结果显示可显著抑制HBV的表达。本研究同时合成了可靶向B244、B376的siRNA,以及针对同样靶点的分别经5’端甲氧基修饰、磷酸化修饰和固醇修饰的siRNA,对HepG2-N10细胞的转染实验结果显示,化学合成的siRNA均能有效下调HepG2-N10细胞HBV蛋白的表达,其中经修饰后的siRNA可表现出更好的抑制效果。为进一步验证本研究获得的siRNA在动物模型体内对HBV表达的抑制效果,本研究应用尾静脉高压注射法和不同基因型的HBV 1.3倍体克隆建立了HBV小鼠模型。通过检测血清样品中HBsAg、HBeAg的表达及HBV-DNA的拷贝数评估靶向B244、B245及B376的siRNA在动物模型对HBV表达的抑制效果,结果显示本研究获得的靶向HBV的siRNA在小鼠体内可显著抑制不同基因型的HBV的表达与复制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 乙型肝炎及乙型肝炎病毒
• 1.1 乙型肝炎
• 1.2.乙型肝炎病毒
• 2 RNA干扰及其研究进展
• 2.1 RNA干扰的发现
• 2.2 RNAi的作用机制
• 2.3 RNAi的特征
• 2.4 RNAi技术的应用
• 3 RNAi用于乙肝治疗的研究
• 4 本论文研究的目的和意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 菌株、质粒、细胞株、实验动物
• 1.3 试剂
• 1.4 常用溶液及培养基本配制
• 2 方法
• 结果与分析
• 1 靶向HBV的siRNA的设计与克隆构建
• 2 不同基因型HBV 1.3倍体克隆细胞瞬时表达模型的构建
• 3 共转染实验检测siRNA对不同基因型HBV的抑制效率
• 4 高效靶向HBV的siRNA的脱靶效应检测
• 5 重组慢病毒和化学修饰方式介导的siRNA体外抗病毒研究
• 6 高效靶向HBV siRNA的体内抗病毒效果验证
• 讨论
• 结论和展望
• 参考文献
• 在校期间发表的论文
• 致谢