论文摘要
土壤中的盐分影响植物的生长发育,自古至今是制约农业发展的一大因素,据估计世界上约有20%的耕地受到盐分影响。目前主要采用两种基本的遗传方法提高植物对盐分的适应能力。一是利用自然遗传变异种,这包括在有选择压的环境中直接筛选和基于数量性状位点作图的标记辅助筛选。二是通过引入新基因或改变现有基因的表达水平来影响对盐分的耐受程度。近年来,NHX基因在植物耐盐育种中发挥着重要作用,NHX为液泡膜中的一种Na+/H+反向运输体,可促进离子在液泡中的分室效应,跨液泡膜的pH为其提供能量。钠离子和氯离子分室在液泡中,不仅可作为有效的渗透调节剂,同时还可减小细胞毒性。启动子在决定基因时空表达方面起着十分重要的作用,随着转基因技术的发明,启动子在植物基因工程中也扮演着重要角色。研究NHX启动子可能为植物基因工程提供新的启动元件。本研究采用反向PCR方法从盐生植物灰绿藜基因组中分离到液泡膜Na+/H+反向运输体基因（CgNHX1）起始密码子上游约3800bp（-1-3800bp）的片断。采用常规PCR从灰绿藜和水稻基因组中分离到长约2000bp、1000bp及500bp的启动子片断。为分析它们的表达调控模式,分别将CgNHX1和OsNHX1启动子不同片段插入到植物双价表达载体pCAMBIA1391Z中GUS基因5′端前,构建了启动子+GUS基因融合表达载体pC1391Z/CgP2000、pC1391Z/CgP1000、pC1391Z/CgP500、pC1391Z/OsP2000、pC1391Z/ OsP1000及pC1391Z/OsP500。用基因枪法将六个载体转化到洋葱表皮中,对CgNHX1和OsNHX1不同长度启动子片断进行本底活性分析,并观察CgP2000和OsP2000在NaCl、PEG6000、ABA和低温胁迫下地动子活性变化,对CgP1000、CgP500、OsP1000和OsP500施以ABA处理确定ABA响应元件的位置。结果为:不同长度启动子片段均具有启动活性,随着启动子片段的递减,单细胞显色强度逐渐变弱,表明在CgNHX1和OsNHX1启动子-1000bp -2000bp间存在增强元件;CgP2000与OsP2000受NaCl、PEG6000、ABA诱导,显色强度较对照增强,对低温诱导反应不明显;OsP2000、OsP1000和OsP500均受ABA诱导,至少在OsP500内存在一个ABA响应元件;CgP2000受ABA诱导,CgP1000和CgP500不受ABA诱导,表明CgP2000的ABA响应元件存在于-1000bp-2000bp之间。为了进一步研究盐生植物CgNHX1启动子和甜土植物OsNHX1启动子在盐生植物中调控方式的差异,通过三种不同途径建立了灰绿藜的再生体系。首先,探讨植物激素、外植体、光暗条件等因子对灰绿藜愈伤组织诱导的影响,结果表明:NAA、2,4-D、IAA在单独使用时,一定浓度范围内均有愈伤组织产生,利用不同的外植体,最佳的诱导组合培养基分别是茎为MS + NAA4.0 mg/L + 6-BA0.5 mg/L,叶为MS + 2,4-D4.0 mg/L+6-BA0.2mg/L,光照有利于愈伤组织的诱导。在优化灰绿藜愈伤组织继代培养条件时,发现5.0 mg/L的抗坏血酸（Vc）对于灰绿藜愈伤组织的褐变有良好的抑制作用,继代培养基中较好的组合为MS + 2,4-D 0.5 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L。愈伤组织不定芽分化培养基为MS+6-BA2mg/L+NAA0.05mg/L,根分化的培养基为1/2MS+NAA0.2 mg/L。其次,选用盐碱地灰绿藜幼嫩花序为外植体,建立了快速而高效的离体培养体系。在附加1.0 mg/L 6-BA和0.4 mg/L IBA的MS培养基上培养35d可诱导出不定芽,诱导频率达到66.7%;不定芽在此培养基上可快速扩增和长期继代培养。不定芽转至1/2MS + NAA 0.2 mg/L培养基中培养23周生根形成完整植株。再次,灰绿藜茎段的组织培养与快速繁殖体系也已建立。其主要培养基为（1）诱导芽萌发及分化培养基:MS+6-BA 1.5 mg/L + IAA 0.4 mg/L;（2）丛生芽的诱导和增殖培养基:MS+6-BA 1.0 mg/L +IAA 0.6 mg/L;（3）生根培养基:1/2MS+NAA 0.2 mg/L。
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