论文摘要
研究背景及目的：低温保存是低温生物学研究中的一项重要技术，而细胞和组织保存的关键问题是解决低温损伤作用。低温保存的实践发现，当组织细胞以单细胞悬液的形式冷冻保存时可以保持更高的活力。最新的研究表明，细胞内的骨架系统对低温保存是不利的，原因可能是其与细胞膜的锚着限制了细胞对渗透压变化的适应性。而对于组织来说，其细胞间连接对细胞间的锚着则进一步加强了细胞骨架对细胞的固定作用，使其运动和形状变化受到更大的限制，因此对冷冻刺激更为敏感。由此可以认为细胞连接是组织低温保存过程中产生损伤的关键部位，其原因与其限制了细胞对体积剧烈变化的顺应性有关。本研究的目的旨在研究皮肤低温储存与细胞连接相关蛋白的变化，从而分析其低温生物学效应，并将几种低温保护剂（cryoprotectant，CPA）进行比较，以期为探索低温组织保存液的有效成分提供科学依据。方法：第一部分实验中，将皮肤组织采用不同的温度组（4℃组、-20℃组、-80℃组和-196℃组）进行保存，并在保存7天、14天、21天、28天后进行实验观察，设新鲜皮肤为对照组。参与细胞连接及信号转导的相关蛋白主要有：α-辅肌动蛋白（α-actinin）、纽蛋白（vinculin）。首先通过HE染色和免疫组织化学染色两种病理学方法在光镜下观察细胞形态和蛋白的改变，并用图像分析仪测定表皮组织中的含量变化。进一步采用RT-PCR和Western-blot对不同方法保存后的α-actinin、vinculin的含量进行了深入研究。力求从细胞连接结构的重要组成部分中寻找到低温损伤的位点，从而更深入了解抗低温损伤的机理。第二部分从海藻糖对皮肤细胞连接相关蛋白的保护作用入手，探讨一种新型的CPA对低温储存皮肤活力的影响。实验将新鲜成人皮肤分为4组，分别经海藻糖／二甲基亚砜（T／D）、二甲基亚砜／丙二醇（D／P）、二甲基亚砜／去血清角质细胞培养液（D／K）、DMEM作为低温保护剂保存，-196℃液氮冻存7天、14天复温，设新鲜皮肤为对照组。采用组织病理HE染色、免疫组织化学染色、琥珀酸脱氢酶（SDH）测定方法，对各组间皮肤活力进行比较。并在此基础上，进一步采用RT-PCR和Western-blot方法对不同低温保护剂保存后皮肤的vinculin、α-actinin蛋白含量和基因水平进行了深入的研究。结果：1、皮肤组织低温储存后其细胞连接相关蛋白vinculin、α-actinin形态结构及分布改变，并且蛋白含量下降，它们可能是低温损伤皮肤细胞连接结构的作用位点。2、应用不同的温度储存皮肤得到不同的保存效果，在-196℃保存时细胞连接相关蛋白含量下降较少，形态改变不显著。3、随着保存时间的延长，低温对细胞连接相关蛋白的损伤作用愈显著，-196℃组所保存的皮肤中细胞连接相关蛋白含量亦逐渐下降。4、通过蛋白分析结果及皮肤活力的测定表明，海藻糖在低温保存过程中，保护皮肤组织细胞连接相关蛋白，其中vinculin、α-actinin的蛋白含量和基因表达量与新鲜皮肤组相似。5、海藻糖／二甲基亚砜组具有提高低温保存皮肤活力的作用，并优于传统保护剂组。结论：细胞连接相关蛋白与皮肤组织的低温损伤机制密切相关，可能是低温损伤的重要位点。而且，海藻糖与二甲基亚砜联合应用是较好的冷冻保护剂，该保护剂可较好的提高冷冻后储存皮肤的活力，为皮库在今后常规应用保护剂时加入海藻糖提供了实验依据。