茉莉酸甲酯处理雷公藤悬浮细胞的基因差异表达分析

论文摘要

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）作为一种具有很好应用和开发前景的农用资源植物,其市场需求日益加大。为利用现代生物技术调控雷公藤次生代谢产物生物碱的生物合成提供依据,本文以茉莉酸甲酯（MeJA）为诱导子,采用继代3周的雷公藤悬浮细胞为材料,通过cDNA-AFLP技术分析了MeJA诱导处理前后雷公藤悬浮细胞中差异基因的表达情况,主要得到了以下结论:1 MeJA在50μM至400μM浓度范围内对雷公藤总生物碱含量的积累呈抑制作用。未用MeJA处理的悬浮细胞中总生物碱的含量达到了624.13μg·g-1,而不同浓度MeJA处理对总生物碱的积累影响不同,其中200μM浓度处理下总碱的含量略高于其他处理浓度,为478.76μg·g-1,仍然低于未用MeJA处理的。2通过优化RNA的提取、酶切、连接、预扩增和选择性扩增等步骤,建立了适宜MeJA诱导下雷公藤悬浮细胞差异基因表达的cDNA-AFLP体系。3利用64对AFLP扩增引物对处理和对照的cDNA进行AFLP分析和Blastn生物信息比对,共筛选到19条明显差异表达的cDNA片段。其中有7条找到同源序列,这些基因可能参与了细胞中的信号转导,转录调控和能量代谢等。12条未在数据库中找到同源信息,推测为未知基因,有待进一步验证。4在比对出的7条TDFs中,A2T4C4片段与MYB蛋白基因同源（Blastn比对结果为100%）。MYB蛋白做为一类转录因子组成的一部分,对揭示次生代谢物转录调节机制有重要意义,推测MYB基因可能参与了茉莉酸甲酯调控的雷公藤悬浮细胞次生代谢物质的合成。对此,有待于获得A2T4C4片段其全长序列,并转入雷公藤悬浮细胞培养体系,在雷公藤悬浮细胞中做转化验证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 雷公藤研究进展
• 1.1.1 雷公藤活性成份研究
• 1.1.2 雷公藤杀虫活性研究概况
• 1.1.3 雷公藤组织培养研究进展
• 1.2 MeJA 在次级代谢产物信号转导中的作用
• 1.3 基因差异表达研究技术
• 1.3.1 mRNA 差异显示（DDRT-PCR）
• 1.3.2 cDNA 代表性差异分析（cDNA-RDA）
• 1.3.3 抑制性消减杂交（SSH）
• 1.3.4 cDNA-AFLP 技术
• 1.4 本研究的立题依据及试验设计思路
• 第二章 材料和方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 菌种和质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 雷公藤悬浮细胞的培养
• 2.2.2 茉莉酸甲酯诱导处理
• 2.2.3 雷公藤悬浮细胞鲜重和干重的测定
• 2.2.4 雷公藤悬浮细胞中总生物碱的提取和测定
• 2.2.5 雷公藤悬浮细胞总RNA 的提取
• 2.2.6 cDNA-AFLP 分析
• 2.2.7 差异条带的分离和测序
• 2.2.8 RT-PCR 验证获得的差异基因在雷公藤悬浮细胞中的表达
• 第三章 结果与分析
• 3.1 不同浓度茉莉酸甲酯对雷公藤悬浮细胞生长量和总生物碱积累的影响
• 3.2 RNA 的提取
• 3.3 选择性扩增
• 3.4 差异片段的二次扩增和克隆
• 3.5 7 条差异片段的基因序列分析
• 3.6 RT-PCR 检测
• 第四章 问题与讨论
• 4.1 MeJA 抑制雷公藤悬浮细胞总生物碱的合成
• 4.2 cDNA-AFLP 生物信息学比对结果
• 4.2.1 MYB 转录因子可能参与了雷公藤悬浮细胞总生物碱的合成
• 4.2.2 与雷公藤次生代谢产物信号转导相关的基因片段
• 4.3 cDNA-AFLP 方法有关问题探讨
• 4.3.1 高质量RNA 的提取
• 4.3.2 降低cDNA-AFLP 技术中的假阳性
• 4.3.3 RT-PCR 结果有待进一步完善
• 4.4 下一步研究计划
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附表：测序并比对的碱基序列
• 致谢
• 作者简介