脉孢霉固体发酵产纤溶酶的溶栓降脂作用研究

论文摘要

血栓病的发病率呈逐年增加的趋势,溶栓是血栓性疾病安全有效的治疗手段。目前临床使用的溶栓剂疗效肯定,但还存在半衰期短,使用剂量大,价格昂贵等缺点。因此,研制高效、特异性强的纤溶酶成为必要。作为溶栓剂来源之一的微生物具有种类繁多,繁殖快,生产周期短,利于工业化生产,产量高,成本低等优点。因此从微生物中获取新的纤溶酶具有一定的优势。好食脉孢霉（Neurospora sitophila）是本实验室分离筛选的。通过浅盘发酵（培养基由豆渣和麸皮干重比为4：1组成）,用生理盐水对发酵48h后的培养物浸提6h得纤溶酶发酵浸提液。浸提液按40%-80%硫酸铵分级盐析后,采用Octyl-Sepharose Fast Flow疏水相互作用层析进行纯化,发现该浸提液中有三个活性组份,命名为组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。然后采用Sephadex G-25凝胶过滤层析、SP-SepharoseFF离子交换层析分别对组份Ⅱ、Ⅲ进一步分离纯化,最终提纯后纤溶酶Ⅲ比活力达到301.27U/mg,总纯化倍数为25.77,活力回收率为4.03%。经SDS-PAGE电泳鉴定达到电泳纯。组份Ⅱ的分离效果不好,估计原因为菌种退化引起产酶不同,故进行菌种的复壮与筛选,利用涂布平板法与Octyl-Sepharose Fast Flow疏水相互作用层析预装柱相结合的方法,筛选出一株产酶活力较高且酶活力稳定的菌株。用制备的脉孢霉纤溶酶粗酶液、组份Ⅱ和组份Ⅲ冻干粉分别进行体外血凝块溶解实验、抗凝血实验和毒理性实验,并研究其对小鼠一般行为的影响。体外抗凝实验表明,脉孢霉纤溶酶粗酶液、组份Ⅱ、组份Ⅱ+Ⅲ具有明显的抗凝血作用,其抗凝血效果明显优于尿激酶；体外溶栓实验表明,脉孢霉粗酶液和各组分对血栓的溶解率均高于80%,明显优于尿激酶对照组；脉孢霉纤溶酶粗酶液、组份Ⅱ、组份Ⅱ和组份Ⅱ+Ⅲ组溶解血栓后的液体中的红细胞分散程度较好,形态完整,对照的尿激酶组血细胞凝集成块状,说明脉孢霉纤溶酶对细胞的损伤小,可以维持细胞的完整形态和功能,其血栓溶解效果要优于尿激酶；小鼠皮下注射试验显示脉孢霉纤溶酶无出血活性；急性毒理试验显示脉孢霉纤溶酶无明显的急性毒性,对小鼠的一般行为和协调运动无影响。高血脂模型组与空白组相比,血清中总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）含量差异均为极显著（p<0.01）,TG含量差异显著（p<0.05）,说明具有血栓倾向的高血脂模型建造成功。脉孢霉纤溶酶可以有效降低具有血栓倾向的高血脂症动物血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-C）水平,并能升高高密度脂蛋白（HDL-C）含量。说明其可以有效的控制高血脂症的形成。饲喂高血脂饲料后高血脂模型组小鼠体重明显增加,饲喂脉孢霉粗酶液高、低剂量组增长速度与空白组相比无显著差异,较高血脂模型组有明显降低,说明脉孢霉纤溶酶可加快脂肪代谢,抑制脂肪在体内的积累。从内脏指数看,脉孢霉纤溶酶高、低剂量组对小鼠内脏均无明显损害,且与高血脂模型组相比较具有一定的保护内脏的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 血栓性疾病的研究现状及治疗药物
• 1.1.1 血栓疾病的现状
• 1.1.2 血栓形成的机制
• 1.1.3 溶栓药物的研究进展
• 1.2 凝血与纤溶
• 1.2.1 凝血与纤溶的基本原理
• 1.2.2 凝血系统
• 1.2.3 抗凝系统
• 1.2.4 凝血系统和纤溶系统的关系
• 1.2.5 抗凝药物
• 1.3 高血脂的研究现状
• 1.3.1 高血脂与血栓关系
• 1.3.2 高血脂症的药物治疗
• 1.4 动物模型
• 1.4.1 小白鼠科学实验的意义
• 1.4.2 化学诱导小鼠建立高血脂模型方法的比较
• 1.5 脉孢霉简介
• 1.6 本课题组对脉孢霉纤溶酶的研究
• 2 脉孢霉纤溶酶的分离纯化
• 2.1 引言
• 2.1.1 酶的分离纯化基本方法
• 2.1.2 本章主要研究内容
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要原料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 主要溶液
• 2.2.5 蛋白浓度测定方法
• 2.2.6 脉孢霉纤溶酶活力的测定
• 2.2.7 粗酶液中硫酸铵浓度的测定
• 2.2.8 固体发酵和粗酶液的制备
• 2.2.9 层析分离
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 Octyl Sepharose Fast Flow 疏水相互作用层析
• 2.3.2 Sephadex G-25 凝胶层析
• 2.3.3 SP-Sepharose Fast Flow 离子交换层析
• 2.3.4 电泳鉴定纤溶酶纯度
• 2.4 本章小结
• 3 脉孢霉菌种复壮与筛选
• 3.1 引言
• 3.2 仪器与试剂
• 3.3 菌种筛选
• 3.3.1 菌种筛选及分纯（稀释涂布平板法）
• 3.3.2 菌株产酶稳定性研究
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 产酶菌株的初筛
• 3.4.2 产酶菌株的复筛
• 3.4.3 用 Octyl Sepharose Fast Flow 疏水预装柱（1mL）进行最终筛选
• 3.4.4 优良菌株的产酶稳定性
• 3.5 本章小结
• 4 脉孢霉纤溶酶体外抗凝溶栓活性
• 4.1 引言
• 4.2 材料与试剂
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 试剂与仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 染色法编号
• 4.3.2 皮下注射给药
• 4.3.3 家兔心脏取血法
• 4.3.4 纤溶酶的抗凝血实验
• 4.3.5 纤溶酶的血栓溶解实验
• 4.3.6 纤溶酶的血栓溶解率实验
• 4.3.7 纤溶酶对正常小鼠一般行为的影响
• 4.3.8 纤溶酶对正常小鼠协调运动的影响
• 4.3.9 纤溶酶的急性毒性实验
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 纤溶酶的抗凝血实验
• 4.4.2 血栓溶解实验
• 4.4.3 纤溶酶的血栓溶解率实验
• 4.4.4 纤溶酶对正常小鼠一般行为的影响
• 4.4.5 纤溶酶对正常小鼠协调运动的影响
• 4.4.6 纤溶酶的急性毒性实验
• 4.5 本章小结
• 5 脉孢霉纤溶酶粗酶液预防小鼠高血脂症的效果
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 脉孢霉纤溶酶粗酶液的制备
• 5.2.2 材料与仪器
• 5.2.3 实验动物
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 动物分组及饲养
• 5.3.2 高脂饲料的制备
• 5.3.3 实验方案设计
• 5.3.4 小鼠体重测量
• 5.3.5 小鼠眼眶动静脉采血方法
• 5.3.6 小鼠血清的制备方法
• 5.3.7 小鼠血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）的测定方法
• 5.3.8 小鼠脏器指数的测定和计算
• 5.3.9 统计学处理
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 小鼠体重变化情况
• 5.4.2 动物血清中各指标的变化情况
• 5.4.3 小鼠血清中 TC、TG 含量变化
• 5.4.4 小鼠血清中 HDL-C、LDL-C 含量变化
• 5.4.5 脏器指数
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢