论文摘要
目的:胶质细胞谷氨酸转运体-1（glial glutamate transporter-1, GLT-1）在脊髓伤害性信息传递过程中发挥重要作用,但在不同的疼痛模型中其作用有所不同。在慢性坐骨神经缩窄性损伤（chronic constriction nerve injury,CCI）、吗啡耐受等慢性病理性痛过程中,上调GLT-1的表达和功能可抑制痛和痛觉过敏的程度,阻断GLT-1则加剧痛和痛觉过敏的产生。而在formalin test以及鞘内注射PGE2、PGF2α和NMDA等诱发的急性痛和痛过敏过程中,抑制GLT-1表达和功能可产生抗伤害性感受的作用。这种差异是不同的疼痛模型所致,还是意味着GLT-1在急性痛和慢性痛中起着相反的作用?更接近临床病理性痛的疼痛模型和更特异性的GLT-1促进剂可为这些问题的解决提供可能。蜂毒（Bee Venom, BV）疼痛模型是一种新的疼痛模型,具有多种疼痛表型。大鼠足底皮下中心部位注入蜜蜂毒溶液不仅引起局部组织炎性红肿,还引起单相的持续1-2 h的自发痛反应和较长时间（48 h以上）的注射部位原发性热和机械性痛觉过敏以及注射对侧相应部位继发性热痛觉过敏,更接近临床病理性痛,是研究炎性病理性疼痛的良好模型。Rothstein 2005年在《Nature》撰文报道β-内酰胺类抗生素如头孢曲松钠（Ceftriaxone,Cef）能够选择性地增强GLT-1的表达和功能,为应用Cef作为特异性GLT-1增强剂用于疼痛研究提供了理论依据。因此,本实验旨在观察Cef对蜂毒炎性痛大鼠自发痛反应及痛觉过敏的影响,以及此过程中GLT-1表达的改变,进一步探讨GLT-1在急性炎性痛和痛觉过敏中的作用,为病理性疼痛的防治提供新的思路和线索。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠77只,体重230±30g,随机分为以下5组（n=11）:1对照组:测定热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值后取材;2 BV 1 h组:给大鼠足底注射BV溶液致炎性痛模型,测定注射后055分钟的自发缩足次数;3 BV 4 h组:给大鼠足底注射BV致炎性痛模型,测定注射后4 h热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值;4 BV 24 h组:给大鼠足底注射BV致炎性痛模型,测定注射后24 h热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值;5 Cef组:腹腔注射Cef溶液,每日一次,连续7天。第7日,右足底注射BV溶液致炎性痛模型,测定注射BV后0～55 min的自发缩足次数和注射BV 4 h的热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值,分别反映自发痛和痛觉过敏的情况。根据Cef的剂量,分为100 mg/kg（Cef100+BV4h）组和200 mg/kg（Cef200+BV4h）组。另设腹腔注射等容积NS的对照（NS+BV4h）组。以上各组均于上述预定的实验程序结束后取材测定脊髓后角GLT-1表达的变化,其中6只动物用于免疫组织化学染色,5只动物用于Western Blot分析。数据用均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和t检验,以P<0.05作为判断差异显著性的标准。结果1自发缩足次数大鼠足底注射BV可以诱导动物产生长达1 h以上的持续、单相性的自发痛反应,表现为自发缩足、舔足甚至咬足行为。高峰时每5 min的缩足次数可达80～90次,至注射后55 min时减少为25次左右。NS+BV4h组或Cef100+BV4h组动物的痛行为表现与单纯蜂毒组无明显不同;Cef200+BV4h组大鼠的自发缩足次数较NS+BV4h组有增多趋势,表现为注射蜂毒后25～40 min期间每5 min的自发缩足次数增多和注射BV后55 min内总累计自发缩足反射次数增多（P<0.05）。2热刺激缩足潜伏期大鼠足底注射BV后4 h,注射部位热刺激缩足潜伏期较对照组明显缩短,在注射部位对侧相应部位热刺激缩足潜伏期也有所缩短（P<0.05）;至注射BV后24 h,注射部位及注射部位对侧相应部位热刺激缩足潜伏期仍短于对照组水平（P<0.05）;上述变化以注射部位更为显著。上述结果表明动物出现了热痛觉过敏。NS+BV4h组与BV4h组无显著性差异。与NS+BV4h组相比,应用Cef后,BV注射部位的原发性热刺激缩足潜伏期显著延长（P<0.05）,且延长程度与Cef的剂量成正比,但各剂量组均未延长至对照组水平;注射部位对侧相应部位的继发性热刺激缩足潜伏期也呈剂量依赖性延长（P<0.05）,其中Cef200+BV4h组基本恢复至对照组水平。3机械刺激缩足阈值大鼠足底注射BV后4 h,注射部位机械刺激缩足阈值较对照组明显下降,至注射BV后24 h注射部位机械刺激缩足阈值仍低于对照组水平（P<0.05）,表明动物出现了机械痛觉过敏;注射部位对侧相应部位未出现明显的机械性痛觉过敏。NS+BV4h组与BV4h组的机械刺激缩足阈值无显著性差异。与NS+BV4h组相比,Cef组注射部位的机械刺激缩足阈值有所增加（P<0.05）,具有一定的剂量依赖性,但均未增加至对照组水平。Cef对注射部位对侧相应部位的机械刺激缩足阈值无明显影响。4 GLT-1表达免疫组织化学染色发现,对照组大鼠L5脊髓节段GLT-1阳性染色颗粒呈点片状弥散分布于脊髓后角的各个板层,ⅠⅡ板层更为密集,左右两侧无明显差异;在同节段的脊髓白质中也可见散在分布。注射BV后1 h脊髓后角GLT-1的表达与对照组相比无明显变化,注射BV后4 h及24 h同侧脊髓后角GLT-1的表达均低于对照组,尤以4 h明显,表现为染色面积、积分光密度值明显减少（P<0.05）。注射对侧脊髓后角GLT-1阳性染色面积、积分光密度与对照组相比无显著差异（P>0.05）。NS+BV4h组与BV4h组在染色面积和积分光密度方面无明显差异。应用Cef后,脊髓后角各个板层GLT-1表达均较NS+BV4h组显著增强,但以脊髓后角浅层更为显著,表现为GLT-1阳性染色面积、积分光密度显著增加（P<0.05）,且呈现一定的剂量依赖性。Western Blot分析显示,与对照组相比,注射BV后1 h大鼠L4L5脊髓节段GLT-1的表达量较对照组无明显差异;至注射蜂毒后4 h,GLT-1表达量降低（P<0.05）,且这种降低一直持续到注射蜂毒后24 h。NS+BV4h组GLT-1表达较BV4h组无明显差异。Cef组GLT-1表达量较NS+BV4h组明显增加（P<0.05）,并且这种增加呈现一定的剂量依赖性。结论:Cef由于其特异性上调GLT-1的表达和功能可剂量依赖性地减轻蜂毒炎性痛过程中的热和机械性痛觉过敏,具有一定程度的抗蜂毒炎性痛过敏作用。但大剂量应用时可增强蜂毒炎性痛过程中的自发缩足行为。