重组人源化单克隆抗体SM09临床前药代动力学和主要药效学研究

论文摘要

重组人源化单克隆抗体SM09为作用于CD20抗原的单克隆抗体,拟申报治疗用生物制品注册分类2类新药。本文的工作旨在对其主要药效学及临床前动物的药代动力学过程做整体评价,为临床研究提供依据。重组人源化单克隆抗体SM09亲和力的测定通过蛋白定量实验将重组人源化单克隆抗体SM09（简称SM09）和商品化靶向CD20单抗美罗华（利妥昔单抗,Rituximab）的蛋白含量进行归一,并用SPR技术测定重组人源化单克隆抗体SM09的解离常数Kd为3.65×10-9M,亲合常数Ka为0.27×109M-1,说明SM09与CD20抗原的结合能力较强。SM09的解离常数与美罗华的解离常数9.55×10-9M相近,为同一数量级。重组人源化单克隆抗体SM09体外药效学研究应用流式细胞仪检测SM09-FITC标记人源非何杰金氏淋巴瘤（NHL）建株的传代细胞株Raji、Ramos和Daudi细胞（Burkitt’s淋巴瘤细胞）,比较表面表达CD20抗原量及CD20阳性细胞百分比。Raji、Ramos和Daudi细胞98%以上为CD20阳性,CD20抗原量表达量从高到低依次为Raii、Daudi、Ramos。基于一系列的细胞实验,考察了SM09对Burkitt’s细胞Raji、Ramos和Daudi细胞的直接生长抑制作用、补体依赖的细胞毒效应（CDC）、诱导凋亡作及抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）。实验证明SM09对Raji、Ramos和Daudi细胞具有以上几种作用。重组人源化单克隆抗体SM09体内药效学研究猕猴单次静脉滴注30mg·kg-1SM09,考察CD20+细胞、T细胞、单核＼巨噬细胞的变化,及滴注后全血红细胞、白细胞和蛋白含量的变化。实验结果表明给药后1小时CD20+细胞迅速减少,并持续保持在较低水平,T细胞、单核＼巨噬细胞没有明显变化,血细胞计数仪检测结果表明滴注后全血红细胞、白细胞和蛋白含量均没有明显变化。生物样品中重组人源化单克隆抗体SM09分析方法的建立用氯胺T方法标记重组人源化单克隆抗体SM09,标记后的125I-SM09经分离纯化,其放化纯度为96.0±0.3%,标记后SM09与高度表达CD20抗原的Raji细胞有高度亲和力并且可以被非标记SM09竞争下来。使用SHPLC和TCA沉淀两种方法测定生物样品中的125I-SM09,经过确证,两种方法的特异性、灵敏度、精密度和回收率均可以满足临床前药代动力学的测定需求。重组人源化单克隆抗体SM09在猕猴体内的药代动力学研究单次给药:猕猴单次静脉滴注不同剂量125I-SM09(100mg·kg-1、30mg·kg-1、10mg·kg-1)后,药代动力学过程符合二房室模型,在所用剂量范围内SM09在猕猴体内呈线性消除。测定总放射性、TCA沉淀放射性和SHPLC放射性三种检测方法的可比性较好。多次给药:猕猴静脉滴注125I-SM09 30mg·kg-1/周×4周,体内药动学符合二房室模型。以总放射性、TCA沉淀放射性和SHPLC放射性三种方法得到的药时曲线下面积AUC0-t,半衰期t1/2β和血浆清除率CL,第4次给药后和第1次给药后相比没有显著性增高,提示连续用药没有药物蓄积,也没有导致药酶的诱导或抑制。第1次给药和第4次给药的血药浓度波动百分数（FI）和波动度（DF）以总放射性、TCA酸沉放射性和SHPLC方法计算均没有显著性变化。重组人源化单克隆抗体SM09在猕猴体内组织分布和排泄组织分布:静脉滴注125I-SM09（10 mg·kg-1）后放射性蛋白主要分布在血清、胃内容、肝,脾和颈部淋巴结也有较高的浓度,说明该药物有一定的靶向性。泌尿系统的放射性较高,提示主要经肾脏排泄。脑、脊髓和肌肉的浓度最低。SHPLC分析猕猴给药后的血清放射性色谱图表明主要是保留时间在8.0 min的原形125I-SM09峰,在其后没有出现明显的125I-标记降解小分子和大分子结合125I-标记峰。排泄:静脉滴注125I-SM09后放射性主要从尿中排泄,少量从粪中排泄,70%的放射性在给药后72小时内已经排泄,72小时以后至31天的排泄较缓慢,168小时的排泄达到90%以上。血浆蛋白结合:空白猕猴血浆体外加入125I-SM09,在室温平衡6h以上进行SHPLC分析,未见与血浆蛋白结合与降解。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写
• 前言
• 第一部分 重组人源化单克隆抗体SM09主要药效学研究
• 第一章 重组人源化单克隆抗体SM09亲和力的测定
• 1.重组人源化单克隆抗体SM09与美罗华的蛋白含量归一实验
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 小结
• 2.BIAcore3000测定重组人CD20抗原与重组人源化单克隆抗体SM09亲和常数实验
• 2.1 实验原理
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 实验结果
• 2.5 小结
• 第二章 重组人源化单克隆抗体SM09体外药效学研究
• 1.Burkitt's淋巴瘤细胞表面CD20抗原的表达
• 1.1 实验原理
• 1.2 实验材料
• 1.3 实验方法和步骤
• 1.4 实验结果
• 1.5 小结
• 2.重组人源化单克隆抗体SM09对Burkitt's细胞的生长抑制作用
• 2.1 实验原理
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法和步骤
• 2.4 实验结果
• 2.5 小结
• 3.重组人源化单克隆抗体SM09对Burkitt's细胞的CDC作用
• 3.1 实验原理
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法和步骤
• 3.4 实验结果
• 3.5 小结
• 4.重组人源化单克隆抗体SM09诱导Burkitt's细胞凋亡作用
• 4.1 实验原理
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验步骤
• 4.4 实验结果
• 4.5 小结
• 5.重组人源化单克隆抗体SM09对Burkitt's细胞介导的ADCC效应
• 5.1 实验原理
• 5.2 实验材料
• 5.3 实验方法和步骤
• 5.4 实验结果
• 5.5 小结
• 第三章 猕猴单次静脉滴注30mg·kg-1重组人源化单克隆抗体SM09后对外周血白细胞的作用和对全血细胞的作用
• 1.实验原理
• 2.实验材料
• 2.1 药品和仪器
• 2.2 动物
• 3.实验方法
• 3.1 实验设计
• 3.2 流式细胞仪检测
• 3.3 血细胞测定
• 4.实验结果
• 4.1 猕猴单次静脉滴注30mg·kg-1重组人源化单克隆抗体SM09后对外周血白细胞的作用结果
• 4.2 猕猴单次静脉滴注30mg·kg-1重组人源化单克隆抗体SM09后对全血细胞的作用
• 5.小结
• 第二部分 重组人源化单克隆抗体SM09非临床药代动力学研究
• 第一章 重组人源化单克隆抗体SM09的125I标记、放化纯度鉴定和生物活性检定
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 2.1 放射性标记
• 2.2 标记反应物的分离纯化
• 2.3 放化纯度鉴定
• 2.4 蛋白含量测定
• 2.5 生物活性检定
• 3.实验结果
• 3.1 标记反应物分离纯化放射性、蛋白洗脱图谱
• 3.2 125I-SM09的放化纯度
• 3.3 标记后生物活性的检定
• 4.结论
• 第二章 SHPLC和TCA酸沉方法测定猕猴生物样品中125I-SM09含量的方法学确证
• 1.SHPLC法测定猕猴血清125I-SM09浓度的方法学确证
• 1.1 实验原理
• 1.2 实验材料
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 灵敏度和线性
• 1.3.2 准确度和精密度
• 1.3.3 回收率
• 1.3.4 稳定性
• 1.4 实验结果
• 1.4.1 灵敏度和线性
• 1.4.2 准确度和精密度
• 1.4.3 回收率
• 1.4.4 稳定性
• 1.4.5 特异性
• 1.5 结论
• 2.三氯醋酸（TCA）沉淀测定生物样品中125I-SM09含量的方法学确证
• 2.1 原理
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 灵敏度及可靠定量低限（LLOQ）
• 2.4.2 线性
• 2.4.3 精密度和回收率
• 2.5 结论
• 第三章 猕猴单次和多次静脉滴注125I-SM09的药代动力学研究
• 1.实验目的
• 2.实验材料
• 2.1 药品及试剂
• 2.2 动物
• 2.3 实验仪器
• 3.实验方法
• 3.1 实验设计
• 3.2 血清药物浓度测定
• 3.3 统计及数据处理
• 4.实验结果
• 4.1 猕猴血清中125I-SM09浓度的测定
• 4.2.猕猴单次静脉滴注不同剂量125I-SM09后血清药物浓度时间变化
• 4.2.1 总放射性法测定血药浓度
• 4.2.2 TCA酸沉法测定血药浓度
• 4.2.3 SHPLC法测定血药浓度
• 4.3 猕猴多次静脉滴注中剂量125I-SM09后血清药物浓度时间变化
• 4.4 猕猴单次静脉滴注不同剂量125I-SM09后药代动力学参数
• 4.4.1 总放射性法
• 4.4.2 TCA酸沉法
• 4.4.3 SHPLC法
• 4.5 猕猴中剂量30mg/kg多次静脉滴注125I-SM09后药代动力学参数
• 5.猕猴单次和多次静脉滴注125I-SM09的药代动力学评价
• 5.1 猕猴单次静脉滴注不同剂量125I-SM09后的药代动力学评价
• 5.2 猕猴中剂量30mg/kg多次静脉滴注125I-SM09后药代动力学评价
• 第四章 125I标记SM09在猕猴体内的分布、排泄和血浆蛋白的结合研究
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 2.1 组织分布实验
• 2.2 粪尿排泄实验
• 2.3 体外蛋白结合实验
• 2.4 统计及数据处理
• 3.实验结果
• 3.1.三氯醋酸（TCA）沉淀测定生物样品125I-SM09含量的方法学确证
• 3.2 猕猴静脉滴注125I-SM09后不同时间各组织放射性分布
• 3.2.1 猕猴静脉滴注125I-SM09后不同时间各组织总放射性分布
• 3.2.2 猕猴静脉滴注125I-SM09后不同时间各组织TCA酸沉放射性分布
• 3.3 猕猴静脉滴注125I-SM09（100mg·kg-1）后放射性从粪尿中的排泄
• 3.4 125I-SM09与血浆蛋白的结合研究
• 4.小结
• 结论
• 参考文献
• 个人简历