己烯雌酚单克隆抗体的制备及初步应用

论文摘要

本研究以己烯雌酚（diethylstilbestrol,DES）为研究对象,通过一系列化学反应合成和纯化得到了己烯雌酚-单-羧基丙基-醚（DES-MCPE）,采用活性酯法将己烯雌酚-单-羧基丙基-醚分别与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）共价偶联,制备了完全人工抗原己烯雌酚-牛血清白蛋白（DES-BSA）,己烯雌酚-卵清蛋白（DES-OVA）。其中DES-BSA作为免疫原,DES-OVA作为包被原。用紫外扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对人工抗原进行初步鉴定,确定偶联成功。分光光度法估算DES-BSA、DES-OVA中半抗原与载体蛋白的偶联比率,最后测DES-BSA的偶联比为17.5:1;DES-OVA偶联比为21:1。将免疫原DES-BSA免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立了2株稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F5和2D8。将1F5、2D8细胞分别注入BALB/c小鼠的腹腔,制备出腹水,并用硫酸铵沉淀法将腹水进行纯化。对两株细胞的上清和腹水进行效价测定,其细胞培养上清效价分别为1:640和1:320,腹水效价达分别为1:3.2×106和1:1.6×106。该两个细胞株体经体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定。对两株单抗进行鉴定:杂交瘤细胞染色体数分别为99.24±2.5和99.45±1.5,其分泌的抗体亚型均为IgG2a。将两株细胞经体外传代和多次冻存复苏后,其抗体分泌稳定。利用1F5杂交瘤细胞株的腹水单抗建立检测己烯雌酚残留的间接竞争ELISA方法。首先确定建立ELISA方法的最佳包被原浓度为1μg/ml,抗体为1:3.2×105稀释。然后对建立的ELISA方法分别从包被时间、封闭液、封闭时间、抗原抗体温育时间、抗体工作液pH值的选择、底物作用时间等条件进行初步优化。绘制出己烯雌酚间接竞争ELISA检测方法的标准曲线:y=-25.629LogC+79.487,R2=0.9881,此方法可测定的最适范围为1～100 ng/ml;检测下限为0.1585ng/ml;定量限为0.1698 ng/ml。在可测定范围内,甲孕酮、甲地孕酮、孔雀石绿、无色孔雀石绿、恩洛沙星、呋喃唑酮、呋喃西林、氯霉素等可能会因为同时使用而导致共同残留的药物未显示交叉反应性。添加回收率试验测得鱼肉样品平均回收率为108.6%,证明建立的间接竞争ELISA方法准确度较高。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 己烯雌酚残留与分析
• 1.1 己烯雌酚概况
• 1.2 己烯雌酚的应用
• 1.3 己烯雌酚残留
• 1.4 己烯雌酚的危害
• 1.5 己烯雌酚的残留检测分析
• 2 人工抗原常用的载体
• 2.1 人工抗原的合成
• 2.2 人工抗原的鉴定及偶联比测定
• 2.3 影响人工抗原免疫原性的因素
• 第二章 己烯雌酚免疫原的制备与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.2 主要仪器
• 1.3 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 己烯雌酚-单-丁酸乙酯基-醚（DES-MEBE）质谱分析
• 2.2 己烯雌酚-单-羧基丙基-醚（DES-MCPE）质谱分析
• 2.3 己烯雌酚-单-羧基丙基-醚（DES-MCPE）红外图谱分析
• 2.4 人工抗原紫外扫描
• 2.5 偶联物蛋白浓度的测定
• 2.6 偶联物中半抗原与载体蛋白结合比的估算
• 2.7 人工抗原及载体SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.讨论
• 3.1 完全抗原的制备
• 3.2 己烯雌酚完全抗原的定性定量分析
• 第三章 己烯雌酚单克隆抗体的制备及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 单克隆抗体的制备
• 2 结果与分析
• 2.1 多抗血清抗体效价和特异性测定
• 2.2 双向免疫扩散法测定抗体效价测定
• 2.3 细胞融合及杂交瘤细胞筛选
• 2.4 纯化腹水蛋白浓度测定
• 2.5 腹水效价测定
• 2.6 杂交瘤细胞染色体分析
• 2.7 单抗亚型分析
• 3 讨论
• 3.1 动物免疫
• 3.2 细胞融合
• 3.3 阳性细胞克隆化
• 3.4 阳性克隆筛选
• 第四章 己烯雌酚间接竞争ELISA方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 包被抗原和一抗工作浓度的确定
• 2.2 DES间接竞争ELISA法条件的优化
• 2.3 标准曲线的绘制
• 2.4 间接竞争ELISA方法分析
• 3 讨论
• 3.1 包被原和抗体浓度的确定
• 3.2 沈涤
• 3.3 ELISA方法灵敏度
• 3.4 ELISA方法特异性
• 3.5 样品前处理
• 第五章 结论及下一步工作设想
• 1 结论
• 2 下一步工作设想
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 致谢