人乳头瘤病毒58型系统地理学分析研究

论文摘要

人乳头瘤病毒58型（HPV58）是具有高度致癌危险性的HPV型别之一。其全球范围内感染率不高,但在亚洲、非洲等地却呈现出不同寻常的流行状况。由于全球HPV58数据分布零散,加之一些高发地区（如中国内地）数据缺乏,迄今为止对世界范围内的HPV58地理分布仍未见较全面的分析报道。系统地理学分析是探讨病毒等物种特殊地理分布的一种有效的生物信息学方法,它避免了大规模耗时耗力的临床筛查,通过对已知病毒（HPV58）核苷酸序列进行分析,从而不仅能追踪病毒的全球地理迁移,还能发现病毒（HPV58）与疾病（宫颈癌）流行的潜在关联。近期,类似的方法已被成功地用于禽流感病毒的分析。中国内地是HPV58的高发区,因此将其数据融入全球数据进行全面的系统地理学分析尤为重要。然而,目前全球已收录的来源于中国内地的HPV58核苷酸序列却十分缺乏（查阅全球最大的基因数据库——GenBank,截止至2008年8月,仅收录两条来自中国内地HPV58序列,一条无功能,另一条为E6基因）,因而在现有数据基础上进行分析很难涵盖中国内地这一特殊的HPV58高发区。本课题在中国内地部分地区多点采集HPV阳性的宫颈癌组织标本,进行HPV58检测,扩充中国内地HPV58序列库（递交入GenBank数据库）;将所获得的中国内地HPV58新序列融入现有GenBank全球数据,利用生物信息学（系统发生、系统地理学、适应性进化等）的方法将多基因（E6、L1）序列信息归并整合,重构HPV58全球进化轨迹,探讨中国内地在全球HPV58的传播、迁徙过程中的作用。本课题分为以下四个部分进行研究:第一部分HPV病毒E6基因与L1基因分型的兼容与归并目的:探讨HPV中E6基因的分型潜力,明确E6基因与L1基因数据的兼容性与可归并性。方法:收集全球GenBank中HPV16簇群7个型别（HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58、HPV67）E6基因区完整（450bp）或近乎完整（≥385bp）的、有功能的158株HPV核苷酸序列,基于E6基因对上述序列进行比对、分型,并基于E6基因单独对全球HPV16型变异株进行系统发生学分析。结果:HPV16簇群内E6基因型内核苷酸序列相似百分比均高于90%,和L1基因相类似,同源性很高;基于E6基因对158条序列（归并相同序列后剩余93条）利用三种方法（UPGMA、ME、NJ）构建的HPV16簇群系统发生树结构基本一致,树型趋于稳定,均能很好地区分各种型别,每一个进化树分支的靴值分析均达99%,可靠性高;对HPV16型变异株单独构建系统发生树也与以往L1基因分析结果类似。结论:E6基因与L1基因可能承受较为均等的进化压力,两者可能均为HPV中较为保守的编码区域;尽管两种基因序列数据零散、互相独立,但在系统发生学上,两者携带的进化信息可能是相互兼容、可归并的。第二部分中国内地部分地区HPV58序列检测分析及其系统亲缘关系分析目的:在中国内地范围内检测HPV58序列（E6基因和L1基因）,探讨中国内地HPV58变异株的序列特点,以及与全球其他HPV58株的系统亲缘关系。方法:在中国内地范围内收集（1996年～2007年,江苏省、四川省、上海市等）人宫颈癌石蜡包埋组织,经DNA提取、扩增、测序等步骤,检测HPV58阳性标本E6基因和L1基因序列。将检测获得的新序列递交入GenBank数据库,并与已有序列合并,基于两种基因（E6、L1）对HPV58进行系统发生学分析。结果:检测获得5条HPV58-E6全长序列（450bp）、2条近全长序列（435bp,436bp）和7条HPV58-L1近全长序列（1,124～1,480bp）,递交入GenBank获得登录号EU999957～EU999970。将检测获得14条HPV58序列（L1、E6）与GanBank已有HPV58序列共同分析,发现中国内地序列多与来自香港、中国西安、日本、菲律宾等的HPV58东南亚洲株同源,且有聚集于树型中下部的倾向。结论:中国内地以及东南亚地区可能在接受“根部”来源的HPV58变异株后形成毒株播散源“中转站”,在全球HPV58的传播、迁徙过程中起着重要作用。第三部分全球HPV58病毒E6及L1变异迁移轨迹目的:将中国内地数据融入现有GenBank全球数据中,重构HPV58全球进化轨迹,探讨中国内地在全球HPV58的传播、迁徙过程中的作用。方法:根据已构建的HPV58-E6、L1两组系统发生树,通过毒株分离源地理信息进行配对,归并两组信息。将树型信息与地理信息叠加标记于世界地图上,标记出HPV58病毒在某个时期内一次或多次的历史性迁移,重构HPV58的全球进化轨迹。结果:E6基因变异迁移轨迹提示了东南亚地区（香港、中国西安）这一重要策源地;而L1基因变异迁移轨迹则明确了HPV58的非洲起源性。两组信息对应补充、相互验证。结论:HPV58毒株可能由非洲西部起源,在东南亚地区形成另一新的重要策源地,HPV58在非洲、东南亚出现高感染率极有可能源于毒株时间上的较早存在（或传入）,亦有可能因为起源较早（接近“根”）的变异株毒力较强。第四部分HPV58适应性进化现象以及HPV58与宫颈癌的关系目的:探讨HPV58区域差异现象发生的原因,是否存在适应性进化现象;初步探讨HPV58与宫颈癌发生、流行的关系。方法:运用自主开发软件计算上述每一次变异事件（变异株序列两两之间）的dn/ds比（即非同义替代与同义替代发生速率比）;将HPV58变异株迁移轨迹与2005年WHO统计全球宫颈癌发病率分布图相整合、对比。结果:HPV58-E6和L1基因分别在7次、8次变异迁移事件中检测到dn/ds＞1。当HPV58由非洲西部传入东南亚地区、东南亚地区自身区域内、从东南亚地区“中转”后传入拉丁美洲、欧洲时,毒株均可能发生了适应性进化。HPV58进化迁移轨迹与全球宫颈癌流行分布关联密切:非洲、亚洲、中南亚岛屿、拉丁美洲等地的宫颈癌高发态势与“非洲→东南亚、拉丁美洲→欧洲、北美洲”的HPV58毒株逐次迁移方式吻合。结论:变异株的适应性进化现象可能是导致HPV58差异流行的主要原因之一,而人群易感性、地理环境等亦有可能是其中原因。HPV58变异株的迁移进化与全球宫颈癌的流行播散,两者关联密切。总结:中国内地以及东南亚地区在HPV58毒株的进化、迁移播散中可能起了重要的“播散中转站”作用;HPV58对全球宫颈癌流行分布的影响可能远远超出人们目前的认知程度,其可能与HPV16、HPV18一样,是主导宫颈癌发生和播散的主要HPV型别之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、HPV58与宫颈癌
• 二、HPV58研究现状
• 三、HPV58与系统地理学
• 四、本课题研究思路
• 参考文献
• 第一部分 HPV病毒E6基因与L1基因分型的兼容与归并
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 中国内地部分地区HPV58序列检测分析及其系统亲缘关系分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 全球HPV58病毒E6及L1变异迁移轨迹
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 HPV58适应性进化现象以及HPV58与宫颈癌的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 总结与创新点
• 附录
• 附录1:综述
• 附录2:研究生期间发表的论文和综述目录
• 附录3:研究生期间参编的专著目录
• 附录4:研究生期间参加会议及报告论文题目
• 附录5:研究生期间的获奖情况
• 致谢