论文摘要
很多蛋白通过构象变化而工作,本论文选择环磷酸腺苷受体蛋白（cAMP receptor protein, CRP）和丙酮酸激酶（Pyruvte kinase, PK）作为研究对象,应用多种技术手段研究其构象变化机理。环磷酸腺苷受体蛋白（cAMP receptor protein, CRP）,也称为分解代谢基因活化蛋白（catabolite gene activator protein, CAP）,是原核生物中一个典型的转录调控蛋白。CRP是由两个相同亚基组成的二聚体,每个亚基中包含两个不同的结构域：较大的N-端结构域主要负责结合环磷酸腺苷（cAMP）分子,而较小的C-端结构域主要负责识别特异的DNA序列。CRP与cAMP结合后,其构象发生变化并与特定序列的DNA结合,该DNA与RNA聚合酶结合后启动转录过程。CRP已经成为构象变化研究中的一个模型蛋白。目前,apo-CRP、CRP-cAMP复合物、CRP-cAMP-DNA复合物、CRP-cAMP-DNA-RNAP复合物晶体结构均已获得。在apo-CRP中,识别DNA的F-螺旋被包埋在内部；当CRP与cAMP结合后,F-螺旋伸展,进而识别特定序列的DNA。尽管人们对该蛋白进行了大量的研究,对其工作机理也有了较深入的认识,但仍有诸多问题等待解决,如apo-CRP、CRP-cAMP2、CRP-cAMP3和CRP-cAMP4的结构已知,但CRP-cAMP,的结构仍未知,而apo-CRP和CRP-cAMP2构象之间发生了很大的构象变化,这使CRP-cAMP相关的结构研究变得尤为重要。丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）是糖酵解中的一个关键酶,在活化离子存在的条件下,PK催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转变为丙酮酸（pyruvate）。PK是由四个相同的亚基组成的同源四聚体,这四个亚基之间形成了两个近似相互垂直的界面：Y-界面和z-界面。每个亚基包含四个不同的结构域：N-端结构域、结构域A、B、C。每个亚基还包含三个色氨酸：Trp-157、Trp-481和Trp-514,其中Trp-157位于活性口袋中,与Z-界砥接近；而Trp-481和Trp-514位于C结构域中,靠近Y-界面。因此,这些色氨酸可以作为良好的荧光探针来研究丙酮酸激酶在活化离子、底物和抑制剂等不同配体诱导下的构象变化机理。PK的B结构域具有很强的动态性,通过B结构域的旋转可以使得B结构域和A结构域之间的活性口袋分别处于“张开”和“关闭”的构象,“张开”的构象代表PK处于活性状态,而“关闭”的构象则代表PK处于非活性状态。虽然基于这两个状态的模型可以很好的描述丙酮酸激酶的变构调控行为,然而,PK具体的催化变构机理仍不明确。针对以上环磷酸腺苷受体等蛋白在构象变化机理研究方面的问题,本学位论文分为五个章节开展研究工作。各章节主要内容如下：第一章是绪论。首先对环磷酸腺苷受体蛋白和丙酮酸激酶的研究概况和发展前景进行了简述,并在此基础上引出了本文的研究方向,即采用结晶学、光谱学、生物物理等技术手段来研究这两种重要功能蛋白的构象变化机理。第二章主要介绍CRP蛋白cAMP结合结构域的表达、纯化、结晶和晶体结构解析。本论文选择两种特别的蛋白水解酶（枯草杆菌蛋白酶和糜蛋白酶）对CRP进行酶切,得到两种CRP的cAMP结合结构域：S-CRP（氨基酸残基1-133）和CH-CRP（氨基酸残基1-137）。本文采用了特殊的结晶方法得到了S-CRP-cAMP和CH-CRP-cAMP复合体的单晶,并对其晶体结构进行了解析,其分辨率分别为2.0A和2.8A。本文着重介绍了S-CRP-cAMP复合物的晶体结构：每个不对称的晶胞中包含四个二聚体,它们整体的折叠情况和二聚化方式与全长的CRP分子相似,根据它们结合cAMP的数量和位置的不同,这四个二聚体可以分为三种类型：S-CRP-cAMP2、S-CRP-cAMP1和S-CRP-cAMP2,。其中, S-CRP-cAMP1和S-CRP-cAMP2都是第一次获得,研究表明一个cAMP分子也可以使得C-helices（残基112-133）得到重排和稳定化。第三章主要介绍CRP蛋白cAMP结合结构域的构象变化和动态性研究。本论文采用了傅里叶变换红外光谱（FT-IR）技术来研究S-CRP和CH-CRP在结合cAMP前后的二级结构组成以及动态性变化。从而明确CRP铰链区（残基134-138）以及loop3（残基53-57）和Phe136的相互作用在cAMP诱导的CRP构象变化和信号传导中的作用。研究表明,cAMP诱导的CRP活化包含显著的二级结构变化：C-helix含量的增加和β strand4或者β strand5含量的减小,即结合cAMP增加了CRP蛋白cAMP结合结构域的稳定性。同时,结合cAMP所引起的C-helix的增加使得S-CRP-cAMP和CH-CRP-cAMP的动态性都有所减小。铰链区的存在使得CH-CRP比S-CRP更具动态性,但是,loop3和CRP铰链区的相互作用没有参与构象变化过程中的信号传导。第四章最主要介绍了不同配体诱导下的丙酮酸激酶构象变化机理的研究。本论文分别对PK的三个色氨酸残基进行了定点突变,并通过荧光淬灭、圆二光谱（CD）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等技术分别对野生态和突变体PK进行了研究。定点突变没有改变PK的二级结构,同时,由活化离子和底物诱导产生的荧光信号的变化主要来源于Trp-157, Phe的结合使得Trp-481和Trp-514处于一个更加亲水环境中。本章重点讨论了B结构域的运动在PK催化反应中的作用,即活化离子所诱导结构域B的旋转使得PK活性口袋“张开”,而底物的结合所引起的结构域B的旋转又使得PK活性口袋“闭合”,从而使得PK的催化反应得以进行。第五章主要介绍丙酮酸激酶催化变构机理的热动力学研究。本论文使用等温量热滴定（TTC）技术,首次得到了PK催化底物反应过程中的热动力学常数,明确了不同活化离子（钾离子和镁离子）和抑制剂（苯丙氨酸）在PK构象变化中的作用。活化离子浓度的增加使得反应体系中的活性状态的百分比含量逐渐增加,而增加抑制剂的浓度则会起到相反的作用。另外,我们提出了钾离子和镁离子诱导PK构象变化的机理,即：首先,镁离子的结合使得PK的活性口袋张开,这一过程非常迅速并且只需要少量的镁离子便可以使得PK从非活性状态转变成这种过渡状态。第二,钾离子随后结合到PK上,定位PK的活性部位,这一过程完成了PK从过渡状态到活性状态的转变。
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摘要Abstract第一章 绪论1. 环磷酸腺苷受体蛋白及其研究概况1.1 CRP蛋白的概述1.2 CRP的结构1.5 CRP与启动子DNA的相互作用1.6 CRP与RNA聚合酶（RNAP）的相互作用1.7 cAMP诱导的CRP的二级结构变化1.8 cAMP诱导的CRP构象变化1.9 cAMP结合口袋1.10 CRP中的loop 3和loop 4的结构和功能1.11 CRP中铰链区的结构和功能2. 丙酮酸激酶及其研究概况2.1 糖酵解途径简介2.2 丙酮酸激酶的概述2.3 丙酮酸激酶的结构2.3.1 PK的活性部位2.3.2 活化离子的结合位点2.3.3 底物的结合位点2.3.4 抑制剂的结合位点2.4 配体诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化2.4.1 活化离子诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化2.4.2 底物诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化2.4.3 抑制剂诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化2.4.4 变性剂诱导下的丙酮酸激酶结构和构象变化2.5. 丙酮酸激酶变构调控的热动力学研究3. 本研究的目的和意义参考文献第二章 CRP蛋白cAMP结合结构域的结晶和晶体结构解析1. 研究背景2. 实验部分2.1 实验设计2.2 实验材料2.2.1 质粒和菌种2.2.2 实验试剂2.2.3 实验仪器2.3 实验方法2法）'>2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）2.3.2 WT-CRP的质粒转化2.3.3 WT-CRP的预表达2.3.4 WT-CRP的大量表达2.3.5 WT-CRP的纯化2.3.5.1 Bio-Rex70层析2.3.5.2 hydroxyapatite离子交换2.3.5.3 Phenyl Sepharose层析2.3.6 WT-CRP的酶切2.3.7 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）的纯化2.3.7.1 Bio-Rex70层析2.3.8 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）的结晶2.3.8.1 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）的浓缩2.3.8.2 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）晶体生长条件的筛选2.3.8.3 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）晶体生长条件的优化2.3.8.4 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）晶体衍射数据的收集2.3.8.5 α-CRP晶体结构解析3. 实验结果与讨论3.1 WT-CRP的预表达3.2 WT-CRP的纯化3.3 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）的纯化3.4 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）的结晶3.4.1 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）的浓缩3.4.2 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）的晶体3.4.3 α-CRP碎片蛋白（S-CRP和CH-CRP）晶体的衍射数据3.4.3.1 α-CRP的晶体衍射图3.4.3.2 α-CRP的晶体衍射数据3.5 S-CRP-cAMP复合体的晶体结构解析3.5.1 第一种类型的S-CRP-cAMP复合体3.5.2 第二种类型的S-CRP-cAMP复合体3.5.3 第三种类型的S-CRP-cAMP复合体3.5.4 三种类型的S-CRP-cAMP复合体之间的关系3.6 CH-CRP的晶体结构4. 本章小结参考文献第三章 CRP蛋白cAMP结合结构域的动态性研究1. 研究背景2. 实验部分2.1 实验设计2.2 实验材料2.2.1 实验试剂2.2.2 实验仪器2.3 实验方法2.3.1 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）的傅里叶变换红外光谱2.3.2 α-CRP的H-D交换反应3. 实验结果与讨论3.1 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）结合cAMP前后二级结构的比较3.1.1 FT-IR吸收谱和二阶导数谱的比较3.1.2 二级结构组成的比较3.2 α-CRP（S-CRP和CH-CRP）结合cAMP前后H-D交换率的比较3.2.1 H-D交换的FT-IR吸收谱和二阶导数谱的比较3.2.2 质子交换率的比较4. 本章小结参考文献第四章 丙酮酸激酶在配体诱导下的变构机理研究1. 研究背景2. 实验部分2.1 实验设计2.2 实验材料2.2.1 质粒和菌种2.2.2 实验试剂2.2.3 实验仪器2.3 实验方法2法）'>2.3.1 大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备（CaCl2法）2.3.2 WT-PK的质粒转化2.3.3 WT-PK的菌种保存2.3.4 WT-PK的质粒扩增与鉴定2.3.4.1 WT-PK的质粒DNA的抽提2.3.5 W481A/W514A-PK和W157A-PK的定点突变与鉴定2.3.5.1 诱导突变基因（PCR反应）2.3.5.2 突变质粒的选择2.3.5.3 突变质粒的转化2.3.5.4 序列分析2.3.6 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的预表达2.3.7 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的大量表达2.3.8 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的纯化2.3.9 丙酮酸激酶的浓度测定2.3.10 丙酮酸激酶的活性测定2.3.11 丙酮酸激酶的圆二色谱测定2.3.12 丙酮酸激酶的傅里叶变换红外光谱测定2.3.13 丙酮酸激酶的丙烯酰胺荧光淬灭2.3.14 不同浓度的盐酸胍（GdnHCl）对丙酮酸激酶的圆二色值的影响2.3.15 不同浓度的盐酸胍（GdnHCl）对丙酮酸激酶的荧光强度影响2.3.16 不同浓度的盐酸胍（GdnHCl）对丙酮酸激酶荧光淬的影响3. 实验结果与讨论3.1 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的预表达3.2 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的纯化3.3 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的浓度3.4 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的活性3.5 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的圆二色谱测定3.6 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的二级结构3.7 WT-PK、W481A/W514A-PK和W157A-PK的荧光淬灭3.7.1 活化离子对丙酮酸激酶的丙烯酰胺荧光淬灭影响3.7.2 底物对丙酮酸激酶的丙烯酰胺荧光淬灭影响3.7.3 抑制剂和变性剂对丙酮酸激酶的丙烯酰胺荧光淬灭影响3.7.4 盐酸胍对丙酮酸激酶的影响3.7.4.1 不同浓度盐酸胍对丙酮酸激酶的圆二色值的影响3.7.4.2 不同浓度盐酸胍对丙酮酸激酶的荧光强度的影响3.7.4.3 不同浓度的盐酸胍对丙酮酸激酶的荧光淬灭的影响3.7.4.4 活化离子和底物对盐酸胍诱导丙酮酸激酶荧光淬灭的影响4. 本章小结参考文献第五章 丙酮酸激酶催化变构机理的热动力学研究1. 研究背景2. 实验部分2.1 实验设计2.2 实验材料2.2.1 质粒和菌种2.2.2 实验试剂2.2.3 实验仪器2.3 实验方法2.3.1 WT-PK蛋白样品的制备2.3.2 丙酮酸激酶的活性测定2.3.2.1 不同钾离子浓度条件下酶活性的测定2.3.2.2 不同镁离子浓度条件下酶活性的测定2.3.2.3 不同抑制剂（苯丙氨酸）浓度条件下酶活性的测定2.3.3 PK催化反应的等温滴定量热实验2.3.3.1 等温滴定微量量热技术2.3.4 酶浓度的影响2.3.4.1 实验条件2.3.5 活化离子和抑制剂浓度的影响2.3.5.1 实验条件一2.3.5.2 实验条件二2.3.5.3 实验条件三3. 实验结果与讨论3.1 丙酮酸激酶活性的测定3.1.1 不同钾离子浓度条件下酶活性的测定3.1.2 不同镁离子浓度条件下酶活性的测定3.1.3 不同苯丙氨酸浓度条件下酶活性的测定3.2 丙酮酸激酶催化反应的等温滴定量热分析3.2.1 酶浓度的影响3.2.2 钾离子浓度的影响3.2.3 镁离子浓度的影响3.2.4 Phe浓度的影响3.3 活化离子和抑制剂浓度对热力学焓变的影响4. 本章小结参考文献论文发表情况致谢
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