幼猪肺泡上皮和血管内皮祖细胞分离培养技术探讨

论文摘要

研究背景肺泡Ⅱ型上皮细胞（Alveolar epithelial typeⅡcells, AECⅡ）是肺泡上皮的祖细胞,能够变为Ⅰ型肺泡上皮细胞参与肺损伤修复,分泌肺泡表面活性物质（Pulmonary surfactant, PS）维持肺泡稳定性、防止肺泡萎陷、保持肺的顺应性,能够将肺泡上皮顶端膜面的钠、水转运至肺间质,并参加了肺对各种吸入有害物质及微生物的天然免疫等。AECⅡ仅占肺部细胞的15%,对肺组织或肺混合细胞的培养难以明确AECⅡ的具体功能。目前尚无具有全部AECⅡ功能的细胞系,AECⅡ的原代培养成为解决这一问题的重要手段。以往研究大多是对成年大鼠、小鼠和兔AECⅡ的分离培养研究,也有少量新生动物细胞分离培养报道,但细胞产量均较低,此外由于小动物生长发育周期及生理病理过程短,生理及解剖特点也不利于长期动物实验研究,对于人新生儿至婴幼儿期的生理和病理生理学研究适用性有限。本研究的目的是建立新生猪AECⅡ分离、纯化及鉴定方法,为AECⅡ的生物学特性研究及与AECⅡ有关的在体动物实验研究奠定基础。目的1、建立新生猪AECⅡ的分离、纯化及鉴定方法；2、观察AECⅡ的体外生长变化特点,明确其体外实验的最佳时间。方法1、取体重1000-1300 g足月新生猪肺,经气道灌入0.1%胰酶及不同浓度弹力蛋白酶与0.1%胰酶的混合酶溶液（40 u／ml elatase／0.1% trypsin、30 u／mlelatase/0.1% trypsin、20 u/ml elatase/0.1% trypsin） 37℃、20 min水浴消化,收集细胞、计数细胞产量及活力；2、采用percoll非连续密度梯度离心及免疫粘附法纯化（即panning法）细胞,计数细胞产量及活力；3、采用透射电镜法、碱性磷酸酯酶染色法鉴定AECⅡ；4、将细胞以4x105 cells／cm2接种于组织培养板,用DMEM低糖培养基（含10%胎牛血清、100 u／ml青霉素、0.1 g／ml链霉素）进行培养,每24 h换液,观察细胞生长变化情况。5、在相同的消化条件下：0.1%胰酶、37℃、20 min水浴消化条件下,对比研究免疫粘附法、percoll非连续密度梯度离心法纯化细胞后所获得大鼠、新生猪AECⅡ的产量、活力及纯度的差别。结果1、新生猪肺组织细胞的消化分离：30 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶消化肺组织后细胞产量（5.35±0.54）x106,而20 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶消化细胞产量为（3.16±0.94）x106,40 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶消化细胞产量为（3.09±0.86）x106,0.1%胰酶消化细胞产量为（2.76±0.65）x10+,30 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶消化细胞产量显著高于其他3组（P<0.01）；2、新生猪肺AECⅡ的纯化：免疫粘附法纯化后的细胞产量为（37.97±27.98）x106,percoll非连续密度梯度离心法纯化细胞的产量（11.07±10.59）x106,前者明显高于后者；3、新生猪肺AECⅡ的培养：原代培养24 h,AECⅡ开始贴壁,细胞呈圆形、多角形,呈岛状分布。培养至48 h,细胞形态一致,为多角形。第3-4天细胞平展,连接成细胞单层,胞浆内有大量反差明显的小颗粒,细胞核明显。第5-7天,细胞内颗粒逐渐减少,胞浆空泡,细胞体积增大,边缘模糊。AECⅡ在原代培养24-96 h处于最佳状态,此阶段适合作体外实验研究。4、在相同消化、分离及纯化方法条件下,新生猪肺AECⅡ的纯化产量明显高于大鼠AECⅡ纯化产量。大鼠AECⅡ的percoll法纯化细胞产量显著高于免疫黏附法。新生猪AECⅡ的纯化,免疫粘附法产量则明显高于percoll法。纯化后大鼠AECⅡ的阳性率近90%,而新生猪AECⅡ的阳性率仅为70%左右。结论1、新生猪AECⅡ消化分离的最佳消化条件是：30 u／ml弹力蛋白酶／0.1%胰酶联合使用,37℃、20 min消化；免疫粘附法纯化新生猪AECⅡ优于percoll法；AKP染色法是简单、实用的AECⅡ鉴定方法,细胞染色阳性率与电镜鉴定结果一致,可用于新生猪AECⅡ的鉴定。2、AECⅡ体外研究的最佳时间为原代培养的第24-96 h。3、在消化条件及纯化方法相同的情况下,新生猪肺AECⅡ的纯化产量明显高于大鼠AECⅡ纯化产量,AECⅡ纯度可达70%左右,可用于进一步的体外实验研究。研究背景内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPC）是循环中骨髓来源的祖细胞之一，能分化为成熟血管内皮细胞，又称为血管内皮细胞的前体细胞。正常生理状态下，外周血中EPC数量很少，缺血、血管损伤等因素可以使外周血中EPC数量增加并参与了损伤血管的修复过程。对急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）的研究表明，炎症反应抑制剂、炎症因子特异性阻断剂等治疗效果并不佳。目前干细胞治疗在组织修复和重建领域中备受关注，EPC很可能是极具前景的急性肺损伤治疗方法之一。本研究的目的是建立幼猪EPC分离培养方法，为EPC对急性肺损伤修复作用机制研究奠定基础。目的建立幼猪外周血EPC体外分离、纯化及鉴定方法，探讨其体外培养条件及生长变化特点。为进一步的EPC生物学特性研究及内皮祖细胞的急性肺损伤修复研究奠定基础。方法取幼猪外周血10-20 ml，用密度梯度离心法分离出血中单个核细胞，贴壁选择法纯化EPC，EGM-2MV培养基（含5％FBS，Hydrocortisone 0．4μl/ml，hFGF-B4μl／ml，VEGF 1 ttl／ml，IGF-11μl／ml，Ascorbic acidμl／ml，hEGF 1μl/ml，GA-10001μl/tl／m1）培养细胞，观察细胞生长变化特点。结果1．使用淋巴细胞分离液（LTS 1110），采用密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞的方法稳定。2．幼猪外周血单个核细胞贴壁选择法纯化后培养观察：细胞贴壁较为缓慢，贴壁细胞大小较为均一、圆形为主。培养7天见较多长梭形细胞，形态相对单一、触角少。长梭形细胞可逐渐增多，培养至3周左右时见长梭形细胞相互连接呈管腔样结构分布。3。透射电镜观察管腔样结构分布细胞：可见细胞间有细胞连接。结论使用淋巴细胞分离液（LTS 1110），密度梯度离心法分离幼猪外周血单个核细胞，贴壁选择纯化的方法，可用于与EPC有关的进一步的实验研究中。

论文目录

缩略语

第一部分

中文摘要

英文摘要

前言

研究目的

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分