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对虾素CHP3和CHP5的原核与真核重组表达及性质研究

2020-11-22阅读(685)

对虾素CHP3和CHP5的原核与真核重组表达及性质研究

论文摘要

抗菌肽是在动物、植物和微生物中广泛存在的一类分子量低、水溶性强、热稳定性好的广谱抗菌活性物质。它是机体受到病原感染后,经过对病原的识别、信号传导进而被激活的一系列免疫效应物中很重要的一类。对抗菌肽的研究有助于加深人们对先天免疫系统作用机制的了解。同时由于抗菌肽的多方面特点,也使得抗菌肽在疾病的预防与治疗、药物的开发、食品的保鲜与储藏以及农业、畜牧业、水产养殖业生产有着巨大的应用前景。 对虾素是一类结构独特的抗菌肽,并在多种对虾中都有发现。目前,将对虾素分为5类,不同的对虾素都表现出对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抗菌活性。对虾素的研究主要集中在对其表达模式、重组表达和结构与活性研究等方面。本实验室首先从中国对虾中克隆得到两种中国对虾素（Ch-penaeidin-3和5,Chp3、Chp5）。本论文将这两种中国对虾素作了重组表达的研究、性质的研究并制备了多克隆抗血清: 1.CHP3、CHP5在大肠杆菌中的重组表达。成功构建了mchp3-pGEX-4T-1、mchp5-pGEX-4T-1重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21。GST-CHP3、GST-CHP5得到高表达量的诱导表达。用亲和纯化的方法对融合蛋白进行了纯化。凝血酶裂解融合蛋白去除GST,用液体抑制的方法对目的蛋白CHP3、CHP5进行了抑菌活性检测。CHP3表现出一定的抑菌活性而CHP5的抑菌活性不强。 2.用大肠杆菌原核表达纯化得到的融合蛋白GST-CHP3、GST-CHP5免疫家兔,制备了兔抗CHP3和CHP5多克隆抗血清,免疫双扩散检测抗血清滴度最高达到8倍稀释,Western blot显示兔抗CHP3多克隆抗血清对大肠杆菌表达的GST-CHP3以及酵母分泌表达的CHP3能较好的识别。兔抗CHP3和CHP5多克隆抗血清的制备为进一步研究中国对虾素的表达模式和杀菌机制打下基础。 3.对CHP3进行了毕赤酵母细胞内表达的研究。构建了带有四个表达框的4×mchp3-pAO815的重组质粒,转化毕赤酵母（Yeast Pichia pastoris）KM71,筛

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • Summary Table
  • 第一章 综述
  • 1. 感染的非己识别
  • 2. 信号的调整和传导
  • 3. 抗菌肽反应系统
  • 4. 对虾素研究进展
  • 5. 抗菌肽研究的意义及展望
  • 第二章 中国对虾素 CHP3、CHPS在大肠杆菌中的表达
  • 1. 材料
  • 2. 方法
  • 2.1 mchp3-pGEX-4T-1、mchp5-pGEX-4T-1重组质粒的构建
  • 2.2 mchp3-pGEX-4T-1/BL21、mchp5-pGEX-4T-1/BL21菌株的诱导表达
  • 2.3 融合蛋白GST-CHP3、GST-CHP5的纯化
  • 2.4 融合蛋白GST-CHP3、GST-CHP5的裂解及 CHP3、CHP5的活性检测
  • 3. 结果
  • 4. 讨论
  • 第三章 中国对虾素 CHP3、CHP5多克隆抗体的制备
  • 1. 材料
  • 2. 方法
  • 2.1 多克隆抗血清制备
  • 2.2 Western Blot验证多克隆抗血清的特异性
  • 3. 结果
  • 4. 讨论
  • 第四章 中国对虾素 CHP3、CHP5在毕赤酵母中的表达
  • 第一节 用pA0815载体胞内表达中国对虾素 CHP3
  • 1. 材料
  • 2. 方法
  • M-T-Easy载体的构建'>2.1 mchp3-PGEM-T-Easy载体的构建
  • 2.2 mchp3-pA0815载体的构建
  • 2.3 mchp3-pA0815二拷贝载体（2×mchp3-pA0815）的构建
  • 2.4 mchp3-pA0815四拷贝载体（4×mchp3-pA0815）的构建
  • 2.5 pA0815、mchp3-pA0815、2×mchp3-pA0815、4×mchp3-pA0815转化毕赤酵母KM71及CHP3 的诱导表达
  • 3. 结果
  • α-A载体胞外分泌表达中国对虾素 CHP5'>第二节 用pGAPα-A载体胞外分泌表达中国对虾素 CHP5
  • 1. 材料
  • 2. 方法
  • α-A重组质粒的构建'>2.1 mchp5-pGAPα-A重组质粒的构建
  • α-A重组质粒转化pichia pastoris KM71及多拷贝的筛选'>2.2 mchp5-pGAPα-A重组质粒转化pichia pastoris KM71及多拷贝的筛选
  • α-A/KM71的表达'>2.3 mchp5-pGAPα-A/KM71的表达
  • 3. 结果
  • 第三节 用pPIC9K载体胞外分泌表达中国对虾素 CHP5
  • 1. 材料
  • 2. 方法
  • 2.1 mchp5-pPIC9K重组质粒的构建
  • 2.2 mchp5-pPIC9K重组质粒转化pichia pastorjs KM71及多拷贝的筛选
  • 2.3 mchp5-pPIC9K/KM71的表达
  • 2.4 CHP5的纯化
  • 2.5 牛津杯法检测 CHP5抗菌活性
  • 2.6 CHPS最小抑菌浓度（MIC）的测定
  • 3. 结果
  • 第四节 讨论
  • 论文总结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 发表和待发表的论文
  • 学位论文评阅及答辩情况表

    • 相关论文文献

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