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根癌农杆菌介导的ACS反义基因转化中国水仙研究

2020-12-07阅读(660)

根癌农杆菌介导的ACS反义基因转化中国水仙研究

论文摘要

本研究以中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）和根癌农杆菌菌株LBA4404为试验材料,首次对根癌农杆菌介导的ACS反义基因转化中国水仙进行研究。主要内容包括:①选择中国水仙高频离体再生途径;②建立并优化再生小鳞茎和愈伤组织两种中国水仙转基因受体系统:③采用根癌农杆菌介导法进行ACS反义基因转化中国水仙并优化转化体系;④筛选抗性小鳞茎并实现其植株再生;⑤对转ACS反义基因的再生小鳞茎（切块）和愈伤组织进行GUS瞬时表达检测;⑥对再生植株叶片进行GUS稳定表达检测和gus基因的PCR检测。主要研究结果如下:1、中国水仙高频离体再生途径的选择。试验以中国水仙鳞茎盘切块、子房切片以及花药等为外植体,对中国水仙离体再生途径进行研究,初步筛选出适合的外植体及其高频的离体再生途径。中国水仙鳞茎在0.1%升汞+3-5滴吐温的试验条件下消毒效果良好,在相对优化的培养基MS+5.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-12,4-D条件下,不同外植体直接诱导小鳞茎再生频率高低依次是鳞茎盘切块、子房切片和花药;在相对优化的培养基MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1BA条件下,不同外植体愈伤组织诱导频率由高至低依次是鳞茎盘切块、花药和子房切片;而在相对优化的培养基MS+5.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-12,4-D条件下,不同外植体来源的愈伤组织诱导小鳞茎再生频率也存在显著差异,其中鳞茎盘切块来源的再生频率最高,而子房切片和花药来源的则依次之。2、中国水仙转基因受体系统的建立及优化。根据中国水仙高频离体再生途径的选择结果并综合考虑再生频率和浸染效果,试验建立再生小鳞茎（切块）以及愈伤组织作为根癌农杆菌介导ACS反义基因转化中国水仙的受体系统。100 mg·L-1和110 mg·L-1卡那霉素浓度分别适合于小鳞茎切块以及愈伤组织进行转化操作的筛选抗生素浓度,而头孢霉素浓度范围在0-300 mg·L-1时,小鳞茎切块、愈伤组织小鳞茎分化率均稳定高于80.00%。在中国水仙遗传转化过程中,9-10月、11-12月以及次年1-3月这3个接种时期均适于转化操作;较优生长调节剂组合为中浓度(5.0 mg·L-1)BA附加低浓度(0.1 mg·L-1)2,4-D,适合于小鳞茎切块受体系统的高频率稳定再生,而影响愈伤组织受体系统小鳞茎再生的主次因子分别是KT、2,4-D以及BA,其中附加高浓度的KT(5.0 mg·L-1)、中高浓度(2.0 mg·L-1)的BA以及低浓度(0.1 mg·L-1)的2,4-D的组合效果最佳,其小鳞茎分化率比优化前提高了近6.00%,且其有效繁殖系数仍保持在12.00以上;试验选择的小鳞茎切块受体系统的继代周期为30 d,愈伤组织受体系统的继代周期为15 d;1/2小鳞茎（外缘有微纵切）微切处理较适合小鳞茎切块受体系统以用于浸染转化操作,而愈伤组织受体系统经细胞学观察研究分析具有较强的分化和再生能力,遗传稳定性良好。3、农杆菌介导的ACS反义基因转化中国水仙。在前述研究基础上,试验对农杆菌介导的中国水仙两种受体系统的遗传转化新策略进行研究,相关较适技术参数显示,相同之处表现在稀释液均为1/2 MS液体培养基,农杆菌活化物均为添加一定浓度的葡萄糖,共培养时间均为4 d,共培养温度均为25℃以及共培养培养基pH值均为5.8等;不同之处则表现在预培养时间前者为6 d而后者为10 d,前处理方式前者为局部针刺而后者为局部针刺+风干30 min,农杆菌重悬液浓度OD600值前者为0.5而后者为0.3,重悬液中添加的蔗糖浓度前者为100 g·L-1而后者为80 g·L-1,浸染液前者为重悬液而后者为重悬液+石英砂以及浸染时间前者为20 min而后者为15 min等。浸染后的两种受体系统在除菌时均采用含有300 mg·L-1的头孢霉素的无菌水来除菌。4、抗性小鳞茎的筛选、植株再生及检测。小鳞茎切块和愈伤组织筛选过程中,间歇筛选方式的抗性小鳞茎分化率较高,而逐步加压、直接筛选方式则依次之。而小鳞茎切块和愈伤组织分化的抗性小鳞茎GUS稳定表达检测中,直接筛选方式抗性小鳞茎阳性率较高,而逐步加压、间歇筛选方式则依次之。总体而言,愈伤组织受体系统的抗性小鳞茎分化率和GUS稳定表达率均高于小鳞茎切块受体系统。经筛选共获得6个转ACS反义基因的中国水仙抗性小鳞茎系。对6个抗性小鳞茎系叶片的gus基因的PCR检测表明,在其中的1个抗性小鳞茎系,gus基因已经导入并整合进中国水仙基因组中。经鉴定后的中国水仙转基因植株经炼苗后已移栽成活。

论文目录

  • 缩写词
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  • 1 农杆菌介导的单子叶植物遗传转化研究进展
  • 1.1 农杆菌介导的遗传转化机理及特点
  • 1.2 影响农杆菌转化单子叶植物的因素
  • 1.2.1 农杆菌特性
  • 1.2.2 单子叶植物
  • 2 水仙花生物技术研究进展
  • 2.1 离体植株再生
  • 2.1.1 直接器官发生途径
  • 2.1.2 间接器官发生途径
  • 2.1.3 体细胞胚发生途径
  • 2.2 相关基因克隆
  • 2.3 遗传转化
  • 2.4 水仙花生物技术的应用
  • 2.5 存在的问题及展望
  • 3 ACS基因研究进展
  • 3.1 ACS基因的生物学功能
  • 3.2 ACS基因的克隆
  • 3.3 ACS基因在植物遗传转化中的应用
  • 4 反义RNA在观赏植物基因工程中的若干应用
  • 4.1 反义RNA在基因功能研究中的应用
  • 4.2 反义RNA在花色修饰和延缓衰老中的应用
  • 4.3 反义RNA在雄性不育资源研究中的应用
  • 5 本研究的内容与意义
  • 5.1 研究内容
  • 5.2 研究意义
  • 第二章 中国水仙高频离体再生途径的选择
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 鳞茎预处理及消毒
  • 1.2.2 不同外植体的获得
  • 1.2.3 培养基
  • 1.2.4 培养条件
  • 2 结果与分析
  • 2.1 中国水仙鳞茎消毒方法的筛选
  • 2.2 中国水仙不同外植体直接诱导小鳞茎
  • 2.3 中国水仙不同外植体诱导愈伤组织
  • 2.4 中国水仙不同外植体来源的愈伤组织诱导小鳞茎再生
  • 3 讨论
  • 3.1 中国水仙鳞茎较适消毒方法的改进
  • 3.2 中国水仙高频离体再生途径及其接种时期的选择
  • 3.3 植物生长调节剂是中国水仙高频离体再生的关键
  • 第三章 中国水仙转基因受体系统的建立及优化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 试剂、根癌农杆菌菌株及载体
  • 1.1.2 受体材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 不同受体材料小鳞茎高频再生稳定性验证
  • 1.2.2 根癌农杆菌的继代保存
  • 1.2.3 不同受体材料对根癌农杆菌的敏感性
  • 1.2.4 受体系统对抗生素的耐受性
  • 1.2.5 受体系统的优化
  • 1.2.6 GUS组织化学法检测
  • 2 结果与分析
  • 2.1 不同受体材料小鳞茎高频再生稳定性验证
  • 2.2 不同受体材料对根癌农杆菌的敏感性
  • 2.3 受体系统对卡那霉素的耐受性
  • 2.4 受体系统对头孢霉素的耐受性
  • 2.5 受体系统的优化
  • 2.5.1 再生鳞茎小切块受体系统的优化
  • 2.5.2 愈伤组织受体系统的优化
  • 3 讨论
  • 3.1 中国水仙遗传转化受体系统再生途径的两栖性
  • 3.2 中国水仙两种遗传转化受体系统特点比较
  • 3.3 再生频率和转化效率是受体系统优化的重点
  • 第四章 农杆菌介导的ACS反义基因转化中国水仙
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 农杆菌对头孢霉素的耐性验证
  • 1.2.2 农杆菌浸染受体材料
  • 1.2.3 共培养
  • 1.2.4 除菌
  • 1.2.5 农杆菌介导转化中国水仙主要影响因子研究
  • 2 结果与分析
  • 2.1 农杆菌LBA4404对头孢霉素的耐性验证
  • 2.2 农杆菌介导中国水仙遗传转化主要影响因子
  • 2.2.1 受体材料预培养对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.2 受体材料前处理对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.3 农杆菌重悬液浓度对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.4 农杆菌稀释液对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.5 农杆菌重悬液中蔗糖浓度对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.6 农杆菌浸染液对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.7 浸染时间对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.8 农杆菌活化物对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.9 共培养时间的选择
  • 2.2.10 共培养温度对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.11 共培养培养基pH值对GUS瞬时表达的影响
  • 2.2.12 不同受体系统对GUS瞬时表达的影响
  • 3 讨论
  • 3.1 农杆菌介导的中国水仙转化环节新策略
  • 3.2 中国水仙不同受体系统遗传操作技术参数的异同
  • 3.3 预培养与前处理在遗传转化中的意义
  • 3.4 遗传转化中共培养的作用机理
  • 3.5 农杆菌介导的单子叶植物遗传转化效果
  • 第五章 抗性小鳞茎的筛选、植株再生及检测
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 植物材料
  • 1.1.2 试验设备
  • 1.1.3 试验试剂
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 抗性小鳞茎的筛选培养
  • 1.2.2 抗性小鳞茎的继代增殖
  • 1.2.3 抗性小鳞茎的膨大、生根及再生植株移栽
  • 1.2.4 再生植株的GUS组织化学法检测
  • 1.2.5 农杆菌质粒DNA的提取
  • 1.2.6 CTAB法提取中国水仙总DNA
  • 1.2.7 gus基因的PCR检测
  • 2 结果与分析
  • 2.1 筛选方式对抗性小鳞茎筛选效果的影响
  • 2.2 筛选抗性小鳞茎的动态过程以及正常抗性系的获得
  • 2.3 中国水仙转基因小鳞茎植株再生及转基因植株移栽
  • 2.4 转基因植株叶片组织化学法检测
  • 2.5 转基因植株叶片PCR检测
  • 3 讨论
  • 3.1 抗性小鳞茎筛选过程中的再生频率问题
  • 3.2 筛选方式与阳性率的关系问题
  • 3.3 遗传转化过程中的基因沉默现象
  • 3.4 转基因的效率问题
  • 第六章 小结
  • 1 中国水仙高频离体再生途径的选择
  • 2 中国水仙转基因受体系统的建立及优化
  • 3 农杆菌介导的ACS反义基因转化中国水仙
  • 4 抗性小鳞茎的筛选、植株再生及检测
  • 参考文献
  • 附录 图版及其说明
  • 在学期间发表论文
  • 致谢

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