论文摘要
在移植免疫耐受机制的研究中,CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）的作用越来越受到大家的重视。Tregs是一类高表达CD25和叉头/翼形螺旋状转录因子（Foxp3）的CD4+T细胞,具有很强的免疫抑制功能。在啮齿类动物研究证明,输注体外生成的Tregs可治愈结肠炎、自身免疫性糖尿病和脑脊髓炎等多种自身免疫性疾病,控制移植物抗宿主病和移植排斥反应。Bai等采用基因敲除粘附分子CD62L的表达,阻断Tregs的在体归巢特性,则移植免疫耐受无法形成。在体使用CD62L抗体也可导致淋巴结中募集的Tregs消失,出现移植物排斥反应。而在阻断CD62L的同时采用FTY720诱导CD62L非依赖性的Tregs归巢能力则可恢复Tregs在淋巴结的聚集及移植物的耐受。上述研究显示,在趋化性作用下Tregs向淋巴结的归巢对其发挥移植免疫耐受作用至关重要,趋化性改变有可能会干扰其在体状态下的免疫抑制作用。虽然采用供体抗原活化可诱导Tregs扩增,扩增的Tregs在体外具有抗原特异性免疫抑制作用,但是Oliveira等采用体外扩增的Tregs输注治疗未能诱导免疫耐受的形成。我们推测,活化后Tregs趋化性改变有可能是导致其在体免疫耐受诱导失败的主要原因。目前许多学者致力于研究体外扩增Tregs再输注诱导免疫耐受,而体外活化、扩增对Tregs趋化性改变很少引起重视。阐明体外扩增的Tregs趋化性改变直接影响其进入体内后迁移转运过程,也给合理设计应用Tregs细胞输注治疗提供有价值的依据。T细胞的增殖分为稳态增殖和活化后增殖两种类型。稳态增殖是指在没有特异性抗原刺激活化的状态下细胞的分裂扩增,有利于维持血液中的细胞数量。而活化后的增殖则存在特异性的抗原刺激和细胞由原有的幼稚或记忆状态变为活化。目前体外扩增多采用CD3、CD28抗体刺激进行非特异性扩增或采用负载抗原的APC刺激扩增,两种方式均为活化后扩增,而活化过程可能会导致趋化性的改变。趋化因子受体的表达是Tregs进行靶向迁移、在特定部位发挥免疫调节作用的结构基础。Tregs可表达CXCR4、CCR4、CCR5、CCR8、E/P-selectin、CD103、CD62L、CCR7、CXCR5等多种趋化因子受体和粘附分子。CCR5是趋化蛋白MIP-1α,MIP-1β、RANTES的特异性受体,主要表达于单核/巨噬细胞及T细胞膜上,具有G蛋白受体所特有的7个跨膜区。已有研究表明:CCR5在Tregs的表达是介导母胎耐受的形成、移植物抗宿主病的控制、慢性感染的形成、肿瘤对免疫监控的逃逸等生理及病理反应的关键趋化蛋白受体。但是CCR5基因多态性研究表明,CCR5Δ32是无活性的受体,在白种人中占1%,CCR5Δ32纯合子受者的移植肾存活期显著延长,进一步表明CCR5在移植免疫中具有重要作用。目前尚无动物模型证实CCR5在诱导移植免疫耐受中的作用,本实验采用CD3/CD28抗体包被磁珠体外活化、扩增Tregs细胞,阐明体外活化的Tregs上CCR5的表达和Tregs功能的变化,以及这种变化对免疫耐受形成的可能影响。现将本课题主要实验方法、实验结果和结论总结如下:一、小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的分离、扩增及鉴定取清洁级C57BL/6小鼠4只,制备小鼠脾细胞悬液,细胞总数大于2×108可进行下步MACS分选。按小鼠CD4+CD25+T细胞分选试剂盒说明书分选CD4+CD25+T细胞,同时得到CD4+CD25-T细胞,作为效应性T细胞。将获得的细胞经台盼蓝染色检测细胞的活力;流式细胞仪检测细胞的纯度和细胞表型;3H-TdR掺入法检测该细胞对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用。结果显示所得细胞活力为（95. 1±1.6） %,纯度为97.36%,胞内因子Foxp3在Tregs细胞的表达率为73.96%,和Tregs混合培养的Teff组cpm值明显低于对照组,Tregs存在（Tregs:Teff = 1:1）的情况下Teff增殖cpm值（3H-TdR掺入率3615.78±109.56）较对照组显著性降低,p<0.01。按“雷帕霉素（RAPA）+rIL-2+CD3/CD28”方案体外扩增Tregs3周。流式细胞仪检测扩增后的Tregs细胞表型;3H-TdR掺入法检测Tregs抑制功能。结果显示,经3周扩增后Tregs可达（105±21）倍数。扩增的Tregs仍具有典型的CD4+CD25+Foxp3+表型特征和较强的免疫抑制功能。二、小鼠CD4+CD25+调节性T细胞活化后CCR5的表达1.采用CD3/CD28抗体包被磁珠,磁珠/细胞为1:1,鼠重组白细胞介素终浓度300U/ml,分别诱导CD4+CD25+调节性T细胞及CD4+CD25-细胞,于5%CO2饱和湿度、37℃孵箱分别培养0、2、4天后收集细胞。流式细胞仪检测该细胞的CCR5膜表达;3H-TdR掺入法检测该细胞对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用。结果显示, CD4+CD25+T细胞CCR5表达随活化时间延长逐渐增强。经CD3/CD28抗体包被磁珠活化4天后的CD4+CD25+T细胞可明显抑制效应性T细胞的增殖,且当两者比例为1∶1时抑制能力最强,抑制率为88.4%。2.分别于Transwell下室即24孔板中加入600μL趋化因子CCL5工作液及BM液对照。将诱导0、2、4d的CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25-T细胞用BM液调整为终浓度5×105 ml-1,分别加入100μL细胞悬液于Transwell上室中。5% CO2、37℃环境下孵育4h,混匀下室细胞,计数进入下室细胞的数量。结果显示,CCL5对活化后的调节性T细胞趋化作用强于新鲜分离的CD4+CD25+T细胞,两者相比差异显著。同一时间点,CCL5对CD4+CD25+T细胞趋化作用弱于CD4+CD25-T细胞。三、在体观察Tregs在移植物局部微环境的分布为了明确体外活化扩增的Tregs输注治疗后在体状态下的趋化特性改变,我们采用“套管法”建立小鼠同种异体颈部异位心脏移植模型（BALB/c供体,C57BL/6受体）。分4组:A组（n=6）,围手术期未给予任何免疫抑制治疗。B组（n=6）,术后3天经小鼠尾静脉输入扩增后的Tregs,2×106个。C组（n=6）,术后给予腹腔注射RAPA 1mg/kg-1体重/天,共注射2周。D组（n=6）,同系移植,即供、受体均采用BALB/c小鼠,术后3天经小鼠尾静脉输入扩增后的Tregs2×106个。根据心脏搏动情况判断移植物功能,完全停跳为排斥反应,存活大于100天为耐受。移植术后第7天,每组中任取2只小鼠,断颈处死,Western blotting测定心脏移植物Foxp3的表达,免疫组化方法测CCR5在移植物局部的表达。结果显示:Tregs细胞输注治疗（B组）明显延迟了移植物急性排斥反应的发生时间,心脏移植物存活（26.00±3.03）天。Tregs细胞输注治疗后,Foxp3蛋白在急性排斥反应的移植心脏中（B组）表达较同系移植组（D组）明显增多。结论一、利用MACS分选系统能够从小鼠脾脏单个核细胞中分离出纯度超过90%的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞,分选所得细胞具有较强活性和功能,满足后续实验的要求。二、采用“RAPA+rIL-2+CD3/CD28抗体包被磁珠”方案扩增后的Tregs仍具有典型的CD4+CD25+Foxp3+表型特征,保持较强的活性和免疫抑制功能。三、CD4+CD25+T细胞活化后CCR5表达较新分离CD4+CD25+T细胞增强。活化后的Tregs对CCL5的趋化性较新鲜分离的Tregs增强。四、活化后增殖的Tregs输注治疗后向移植物的趋化明显增强,可明显减轻排斥反应,延长移植物的存活。