核糖体蛋白L13与去乙酰化酶SirT1之间的关系及其生物学功能的研究

论文摘要

酵母Sir2基因编码的表达产物是一种去乙酰化酶,依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD发挥活性作用,能够显著的延长酵母寿命。哺乳动物Sirtuin家族在进化上与酵母Sir2高度同源,家族七个成员(Sirt1~Sirt7)都包含一个含有275个氨基酸组成的核心催化结构域,依赖NAD行使去乙酰化酶功能,在生物体内参与很多重要的新陈代谢的过程。Sirt1是最早被发现的,也是被研究最多的Sirtuin家族成员,他不仅仅是一个去乙酰化酶,还参与到许多信号传导途径中,更通过影响许多已报道的重要的蛋白的活性从而参与许多重要的生理活动,影响细胞代谢,长寿,细胞存活,生长,分化,衰老,凋亡,癌症等等。核糖体是生物体合成蛋白质的重要场所,存在所有的生物体中。核糖体由大小两个亚基组成,小亚基负责读取信使RNA上面的信息,而大亚基负责将募集来的氨基酸连成肽链。核糖体蛋白是核糖体重要的组成成分,与核糖体RNA一起共同组成核糖体,行使蛋白质合成的功能,近些年来核糖体蛋白又被发现有除了合成蛋白质以外的其他功能。哺乳动物核糖体由60S大亚基和40S小亚基组成,60S核糖体蛋白L13是由RPL13基因编码而成,是核糖体大亚基蛋白中的一种,属于L13E家族,又名BBC1.在这个课题中,我们创新性的发现L13是SirT1的一个新的结合蛋白,在细胞中有共同的空间定位,L13可以显著的降低SirT1的蛋白水平而不是mRNA水平,我们发现L13可以促进SirT1的泛素化。我们引入了去泛素化酶,如usp2a, usp2b, uch11, uch12。共转这些去泛素化酶能够抑制L13对SirT1的泛素化降解,我们还发现了在核糖体压力情况下L13与SirT1的结合增强,证明了在核糖体压力下L13和SirT1的相对变化。我们的工作还有很多不足之处,还需要进一步完善和改进。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 第一节 组蛋白去乙酰化酶
• 1.1 组蛋白去乙酰化酶
• 1.2 Sirtuins家族
• 1.3 SirTl基因的结构以及研究进展
• 1.4 SirTl活性的调控
• 第二节 核糖体蛋白
• 2.1 核糖体简介
• 2.2 核糖体的生物发生
• 2.3 核糖体合成蛋白的过程
• 2.4 核糖体蛋白及其功能研究进展
• 第二章 材料和方法
• 第一节 实验材料
• 1.1 实验试剂和药品
• 1.2 抗体
• 1.3 细胞株
• 1.4 载体及引物
• 1.5 菌株
• 1.6 实验仪器
• 1.7 实验耗材
• 1.8 实验平台
• 第二节 实验方法
• 2.1 质粒的构建与提取
• 2.2 细胞培养技术
• 2.3 免疫共沉淀技术
• 2.4 免疫荧光染色
• 2.5 泛素化修饰实验
• 2.6 双荧光素酶报告基因技术
• 2.7 Western Blot技术
• 2.8 病毒包装技术
• 2.9 稳定转染细胞株构建技术
• 2.10 反转录PCR技术
• 第三章 结果与分析
• 第一节 RPL13与SirT1相互作用的发现
• 1.1 构建核糖体蛋白
• 1.2 核糖体蛋白RPL13与SirT1结合的发现
• 1.3 核糖体蛋白RPL13与SirT1共同表达时SirT1蛋白定位的改变
• 1.4 核糖体蛋白RPL13过表达时内源SirT1蛋白定位的改变
• 第二节 RPL13与SirT1在哺乳动物细胞中相互结合
• 2.1 RPL13与SirT1在哺乳动物细胞中相互结合
• 2.2 RPL13与SirT1的结合区域
• 第三节 RPL13在蛋白水平上影响SirT1的稳定性
• 第四节 RPL13对SirT1的翻译后修饰
• 第五节 RPL13响应核糖体压力（ribosomal stress）
• 5.1 L13响应核糖体压力
• 5.2 核糖体压力下SirT1和RPL13结合增强
• 第六节 RPL13影响SirT1的功能
• 第七节 其他
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录Ⅰ 英文缩写