Caspase-3细胞定位信号的检测与分析

论文摘要

细胞凋亡（apoptosis）是多细胞生物机体在生理或病理状态下细胞发生的一种自发的程序化死亡过程,是发育及成熟个体中维持体内平衡（homeostasis）的一种正常事件。它的发生受到机体的严密调控。凋亡途径分为外源性与内源性两种,前者由胞外凋亡信号如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、Fas配体（Fas ligand）分别与细胞膜表面的凋亡受体TNFR1和Fas结合,促使这两种受体三聚化,三聚体的TNFR1或Fas通过自身的死亡域结构（death domain,DD）和接头蛋白FADD中的DD结构域相互作用,在胞浆中募集FADD,形成FasL-Fas-FADD或TNF-TNFR1-FADD,即死亡诱导信号复合物（death-inducing signal complex,DISC）。DISC中的FADD又通过其死亡效应域（death effector domain,DED）与caspase-8前体的DED相互作用,募集caspase-8前体,且自身激活,然后活化下游的caspase-3,导致细胞的凋亡。内源性凋亡则是由于离子照射、化疗药物、线粒体损伤等诱发,由Bcl-2家族中促凋亡因子使细胞色素C（cytochrome C）从线粒体释放入胞浆,与Apaf1、ATP/dATP结合成复合物,称凋亡体（apoptosome）,凋亡体中的Apaf1通过其胱天蛋白酶募集域（caspase recruitment domain,CARD）与胱天蛋白酶-9（caspase-9）前体的CARD相互作用,从而募集casepase-9并自我激活,活化下游的胱天蛋白酶-3（caspase-3）,导致细胞的凋亡。内、外源途径自caspase-3以下完全相同。Caspase-3是调节细胞凋亡的关键蛋白质,为内外源途径所共有。凋亡过程中,胞质定位的Caspase-3被酶解激活,进入细胞核中执行功能。这一定位变化的分子机制至今仍不清楚。细胞核膜上的核孔复合物（nuclear pore complex,NPC）是核质间运输的通道,大分子物质如蛋白质出入胞核需要核定位信号（nuclear localization signal,NLS）和核输出信号（nuclear export signal,NES）。分析caspase-3分子中是否所含NLS和NES可为深入了解其移位机制提供重要的线索。我们构建了一系列Caspase-3不同缩短突变体,与GFP融合表达,观察它们在细胞中的定位,以鉴定Caspase-3分子中所含的核输出信号NES（Nuclear Export Signal）和核定位信号NLS（Nuclear Localization Signal）。结果发现,Caspase-3分子中不存在明显的NLS,但存在一个NES,该NES位于caspase-3小亚基的C端,包括220～245氨基酸残基。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分：含六个CASPASE-3 截短突变体的载体构建与细胞转染
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.讨论
• 第二部分：进一步明确截短突变体C35L 中的NES 信号
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3. 实验结果
• 4 讨论
• 第三部分：转染细胞表达的融合蛋白的WESTERN BLOT
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附图
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文