阳离子聚磷腈衍生物的合成与修饰及其作为基因非病毒载体的研究

论文摘要

为了对新型阳离子聚磷腈基因非病毒载体作出初步评价,分别进行了叔胺类和伯胺类两种阳离子聚磷腈衍生物的合成,并进一步对伯胺类聚磷腈进行了咪唑丙烯酸和半乳糖的修饰,以达到增加聚合物的溶酶体逃逸能力和主动靶向能力的目的。在对合成的聚磷腈衍生物进行结构表征之后,对聚合物与DNA自组装纳米粒进行了体外特性和体外转染的研究,并且对半乳糖修饰聚磷腈与DNA自组装纳米粒在人肝癌细胞BEL-7402皮下移植瘤小鼠的体内转染也进行了初步研究。叔胺类聚磷腈衍生物的合成包括聚DMAEA/Boc—组氨酸甲酯磷腈（PDHP）和不同咪唑取代度的聚咪唑/DMAEA磷腈（PIDP）。Boc—组氨酸甲酯取代比例为13%的PDHP和咪唑取代度为17%的PIDP1在与DNA比例为10:1（重量比）时均自组装形成100 nm左右并带有一定正电荷的纳米粒,该纳米粒在无血清转染介质的293T细胞中均有较高的体外转染效率,比相同条件下PEI/DNA纳米粒的转染效率分别高出1倍和2倍,也远远高出DMAEA全取代的PDAP/DNA纳米粒的转染效率,且细胞毒性远远低于对照组PEI/DNA自组装纳米粒。伯胺类聚2—甘醇胺磷腈（PAEP）/DNA自组装纳米粒在有血清转染介质中能有效转染且细胞毒性远远小于对照组PEI/DNA自组装纳米粒。对PAEP进行咪唑丙烯酸的修饰合成得到取代度分别为7%和25%的两种衍生物,随着咪唑丙烯酸的取代度的增加,其正电荷量随之降低,细胞毒性也相应降低,缓冲能力比未取代的PAEP有所增加,细胞摄取水平有所提高,转染效率也有不同表现。其中咪唑丙烯酸取代度为7%的UA7-PAEP/DNA自组装纳米粒比取代度25%的UA25-PAEP/DNA自组装纳米粒以及未取代的PAEP/DNA自组装纳米粒在Hela细胞和COS 7细胞相同转染条件下的转染效率均明显提高。PAEP/DNA、UA7-PAEP/DNA和UA25-PAEP/DNA自组装纳米粒在Hela细胞和COS 7两种细胞中的转染效率均受到质子泵抑制剂的抑制,说明三种纳米粒的转染效率均与溶酶体酸化过程密切相关。考察了水和pH5.7醋酸盐缓冲液两种制备介质对纳米粒转染效率的影响后发现,在pH5.7醋酸盐缓冲液中制备的UA7-PAEP和UA25-PAEP/DNA自组装纳米粒的转染效率比在水中制备的纳米粒的转染效率有明显的提高,尤其是咪唑丙烯酸取代程度较高的UA25-PAE,而对PAEP/DNA自组装纳米粒的转染效率影响不大,总之,将PAEP聚合物进行7%咪唑丙烯酸的取代之后,不仅体外传染效率最高,而且明显降低了该聚合物的细胞毒性。为了进一步提高伯胺类聚磷腈PAEP对肝癌细胞的主动靶向性,本课题合成了5%半乳糖取代的LA-PAEP,在与DNA比例为20:1时自组装形成粒径在130 nm左右的纳米粒。该LA-PAEP/DNA纳米粒的细胞毒性比PAEP/DNA纳米粒和PEI/DNA纳米粒对照组明显降低,其在BEL-7402人肝癌细胞中的摄取以及荧光素酶的表达都明显高于Hela细胞,在BEL-7402人肝癌细胞中的转染效率也高于PAEP/DNA纳米粒。竞争性拮抗实验表明,在游离半乳糖的存在下,LA-PAEP/DNA纳米粒在BEL-7402人肝癌细胞中的转染效率明显降低,表明该纳米粒为受体介导途径入胞。在体内转染实验中,LA-PAEP/DNA纳米粒在人肝癌细胞BEL-7402移植瘤小鼠肿瘤组织的表达高出PAEP/DNA纳米粒2倍,PEI/DNA纳米粒在肿瘤组织的表达量最高。以上实验表明,LA-PAEP/DNA纳米粒在体内表现出BEL-7402肿瘤组织的靶向性。此结果与其体外靶向肝癌细胞的转染结果基本一致,说明纳米粒在体内外的转染具有一定的相关性。综上所述,叔胺类聚磷腈与伯胺类聚磷腈/DNA自组装纳米粒及其分子修饰纳米粒均能有效转染报告基因,细胞毒性均明显低于PEI/DNA纳米粒对照组。因此本课题设计的阳离子聚磷腈衍生物,为发现高效低毒的基因非病毒载体系统提供了参考依据,为聚磷腈高分子材料在基因递送系统方面展现了较为广阔的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一章 叔胺类聚磷腈衍生物的合成与表征
• 第一节 聚DMAEA/Boc-组氨酸甲酯磷腈（PDHP）的合成与表征
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 聚DMAEA/Boc—组氨酸甲酯磷腈（PDHP）的合成
• 2.2 聚DMAEA磷腈（PDAP）的合成
• 2.3 聚DMAEA/Boc—组氨酸甲酯磷腈（PDHP）的结构表征
• 3 实验结果
• 讨论
• 第二节 聚咪唑/DMAEA磷腈（PIDP）的合成与表征
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 聚咪唑/OMAEA磷腈（PIDP）的合成
• 2.2 聚咪唑/DMAEA磷腈（PIDP）的结构表征
• 3 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二章 叔胺类聚磷腈衍生物/DNA纳米粒的制备、体外特性与体外转染研究
• 第一节 PDHP/DNA自组装纳米粒（PHSNs）的制备、体外特性与体外转染研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 PHSNs的制备与粒径、ζ电势的测定
• 2.3 DNA凝胶阻滞实验
• 2.4 细胞毒性实验
• 2.5 PHSNs在293T细胞中的体外转染研究
• 3 实验结果
• 3.1 PHSNs粒径与ζ电势的测定结果
• 3.2 DNA凝胶阻滞实验结果
• 3.3 细胞毒性实验结果
• 3.4 PHSNs在293T细胞中的体外转染结果
• 讨论
• 第二节 PIDP/DNA自组装纳米粒（PISNs）的制备、体外特性与体外转染研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 PISNs的制备与粒径、ζ电势的测定
• 2.3 DNA凝胶阻滞实验
• 2.4 细胞毒性实验
• 2.5 PISNs的体外转染研究
• 2.6 PISNs的"质子海绵"作用验证实验
• 2.7 PIDP1的体外降解特性研究
• 3 实验结果
• 3.1 PISNs的粒径与ζ电势测定结果
• 3.2 DNA凝胶阻滞实验结果
• 3.3 细胞毒性实验结果
• 3.4 PISNs的体外转染结果
• 3.5 PISNs的"质子海绵"作用验证实验结果
• 3.6 PIDP1的体外降解特性研究结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三章 伯胺类聚磷腈及其分子修饰衍生物的合成与表征
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法与内容
• 2.1 伯胺类聚2—甘醇胺磷腈（PAEP）的合成与表征
• 2.1.1 Boc-2-甘醇胺的合成
• 2.1.2 聚（Boc-2-甘醇胺）磷腈的合成与表征
• 2.1.3 聚2—甘醇胺磷腈（PAEP）的合成与表征
• 2.2 咪唑丙烯酸修饰PAEP（UA-PAEP）的合成与表征
• 2.3 半乳糖修饰PAEP（LA-PAEP）的合成与表征
• 3 实验结果
• 3.1 聚（2-甘醇胺）磷腈（PAEP）的合成与表征
• 3.2 UA-PAEP的合成与表征
• 3.3 LA-PAEP的合成与表征
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四章 PAEP/DNA和UA-PAEP/DNA自组装纳米粒的制备、体外特性与体外转染研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 纳米粒的制备与粒径、ζ电势测定
• 2.3 DNA凝胶阻滞实验
• 2.4 PAEP与UA-PAEP的pH缓冲能力实验
• 2.5 纳米粒的细胞毒性实验
• 2.6 纳米粒的体外转染研究
• 2.7 纳米粒的细胞摄取实验
• 3 实验结果
• 3.1 纳米粒的粒径与ζ电势的测定结果
• 3.2 DNA凝胶阻滞实验结果
• 3.3 纳米粒的pH缓冲能力实验结果
• 3.4 纳米粒的细胞毒性实验结果
• 3.5 纳米粒的体外转染结果
• 3.6 纳米粒的细胞摄取实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第五章 半乳糖修饰聚磷腈（LA-PAEP）/DNA纳米粒的制备、体外特性与体内外转染研究
• 第一节 LA-PAEP/DNAf内米粒的制备、体外特性与体外转染研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 LA-PAEP/DNA纳米粒的制备与粒径、ζ电势测定
• 2.3 DNA凝胶阻滞实验
• 2.4 LA-PAEP/DNA纳米粒的体外转染研究
• 2.5 LA-PAEP/DNA纳米粒的细胞摄取实验
• 2.6 LA-PAEP/DNA纳米粒的细胞毒性实验
• 3 实验结果
• 3.1 LA-PAEP/DNA纳米粒的粒径与ζ电势测定结果
• 3.2 DNA凝胶阻滞实验结果
• 3.3 LA-PAEP/DNA纳米粒的体外转染结果
• 3.4 LA-PAEP/DNA纳米粒的细胞摄取实验结果
• 3.5 LA-PAEP/DNA纳米粒的细胞毒性实验结果
• 讨论
• 第二节 LA-PAEP/DNA纳米粒的体内转染研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验动物
• 3 实验方法与内容
• 3.1 动物肿瘤模型的建立
• 3.2 LA-PAEP/DNA纳米粒体内转染实验
• 3.2.1 LA-PAEP/DNA纳米粒的制备
• 3.2.2 LA-PAEP/DNA纳米粒的体内转染实验
• 4 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 创新点
• 已发表和拟发表论文情况
• 综述
• 致谢