绿色荧光蛋白基因（gfp）转化柑橘及植株再生

论文题目: 绿色荧光蛋白基因（gfp）转化柑橘及植株再生

论文类型: 硕士论文

论文专业: 果树学

作者: 刘歆

导师: 郭文武

关键词: 柑橘,绿色荧光蛋白,根癌农杆菌,遗传转化

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 柑橘是世界第一大水果。通过遗传改良方法创造优质、多抗及不同成熟期的品种类型,是我国柑橘育种研究的重点。然而柑橘属植物存在珠心胚干扰、童期长、雄雌性败育等现象,传统育种手段效率不高、进程缓慢。近年来,不断完善的转基因技术为我们提供了一种更加快速直接的育种和品种改良手段。本实验以柑橘愈伤组织和试管播种实生苗上胚轴为外植体,用根癌农杆菌介导法进行绿色荧光蛋白基因（gfp）的转化,获得14个品种的转基因材料,同时对转化程序、转化机制和外源基因表达进行了探讨与分析。一些带有GFP标记的材料已用于本课题组的细胞融合和细胞凋亡等研究。众多的转基因柑橘细胞系还为后期的遗传转化相关机制研究提供了试材和便利。主要结果如下: 1)在得到的14个品种的转基因材料中,2个品种获得了再生植株,1个品种得到了试管苗,5个品种处于胚状体阶段,6个品种尚在愈伤组织阶段。 2)共得到来自不同转化事件的细胞系/株系93个,将进行Southern Blot分析,研究外源基因在柑橘中的整合规律（整合位点、拷贝数）。 3)温州蜜柑品种国庆一号（G1）的转GFP基因愈伤组织荧光表达强烈且稳定,已成为本课题组细胞融合和细胞凋亡研究的一个活体工具材料。 4)比较了抗生素筛选与GFP荧光筛选的精确性及其对转化进程的影响,证实GFP筛选比抗生素筛选更快速、简便、可靠,GFP标记的应用大大缩短了转化所需的工作量和时间。 5)对决定柑橘愈伤组织转化效率的几个因素进行了比较与分析,表明: ①转化效率的前期决定因素是农杆菌与愈伤组织细胞的互作,以下操作可使这种互作有利于转化效率达到较高水平:由继代历史不超过2年的农杆菌菌株新长出的菌液侵染生长旺盛、颗粒状明显的淡黄色愈伤组织悬浮细胞,先摇动侵染体系使二者充分接触,然后静置20min使农杆菌稳定附着在植物细胞壁上;在侵染后共培养前使愈伤组织细胞造成损伤或在共培养基中加入创伤诱导因子（如AS）均有利于农杆菌Vir基因的活化和T-DNA转移。

论文目录:

摘要

Abstract

1. 课题的提出

1.1 课题的背景

1.2 课题的目标

1.3 前人研究进展

1.3.1 柑橘转基因研究

1.3.1.1 概况

1.3.1.2 柑橘农杆菌转化研究的几个方面

1.3.2 GFP研究

1.3.2.1 概况

1.3.2.2 GFP在柑橘研究上的应用

2. 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 外植体材料

2.1.2 农杆菌

2.1.3 所用主要培养基配方

2.1.4 主要生化试剂

2.2 方法

2.2.1 将质粒转入农杆菌

2.2.1.1 提取质粒DNA(碱裂解法)

2.2.1.2 制备感受态农杆菌细胞

2.2.1.3 质粒转化(热激法)

2.2.2 农杆菌转化柑橘愈伤组织和上胚轴

2.2.2.1 柑橘外植体材料的准备

2.2.2.2 农杆菌侵染液的制备

2.2.2.3 侵染与共培养

2.2.2.4 GFP荧光检测

2.2.2.5 筛选培养、再生与移栽

2.2.2.6 分子检测: PCR,Southern Blot

2.2.2.6.1 柑橘基因组DNA的提取

2.2.2.6.2 转化柑橘材料的PCR鉴定

2.2.2.6.3 部分转化材料的Southern杂交分析:

3. 结果与分析

3.1 已得到的转化材料及其再生状况

3.2 愈伤组织转化

3.2.1 转化率

3.2.1.1 转化率统计

3.2.1.2 影响转化率的内因——受体材料与农杆菌的互作

3.2.1.3 影响转化率的外因——实验操作

3.2.2 各转化材料再生

3.2.3 转化材料中的GFP表达

3.3 试管实生苗上胚轴和子叶的转化

3.3.1 再生体系

3.3.2 转化效率

3.3.2.1 转化率统计

3.3.2.2 转化率分析

3.3.3 嵌合体

3.3.4 表达量变化

3.4 PCR鉴定和Southern杂交分析

4. 讨论

4.1 农杆菌介导的柑橘遗传转化中外植体及其再生途径的选择

4.1.1 愈伤组织

4.1.2 上胚轴

4.2 转化试验体系的优化

4.2.1 外植体

4.2.2 农杆菌

4.2.3 试验操作

4.3 GFP在遗传转化中的应用及注意事项

4.3.1 优越性

4.3.2 注意事项

4.3.3 存在的问题

4.4 GFP作为细胞系标记在柑橘研究中的应用

5. 总结与展望

5.1 本研究成果以及有待改进之处

5.2 基于本实验可以开展的下一步工作

参考文献

图版说明

图版1 GWZ再生过程中的GFP表达

图版2 GWZ嵌合体

图版3 BTC再生过程中的GFP表达

图版4 BTC转化再生过程

致谢

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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[5].钾提高苹果树抗腐烂病机制研究[D]. 李玲南.西北农林科技大学2018
[6].巨球百合离体再生和遗传转化研究[D]. 李岳.浙江大学2017
[7].梨果实愈伤组织对黑星病菌侵染的响应机制研究[D]. 赵军.山西农业大学2017
[8].外源生长调节剂及抹芽处理对葡萄硬枝嫁接的影响[D]. 高博.甘肃农业大学2018
[9].葡萄胚性悬浮系建立及原生质体分离研究[D]. 范琪.甘肃农业大学2018
[10].苹果MdBAK1s基因表达载体构建、愈伤转化与苹果轮纹病抗性鉴定[D]. 吕萍萍.山东农业大学2016

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