8-异戊烯基柑橘素对骨代谢相关细胞的影响及分子机制研究

论文摘要

骨质疏松症是以骨量减少、骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病，是骨代谢失衡的结果。骨质疏松的严重后果是骨折，骨质疏松性骨折不但降低患者生活质量，而且会给患者家庭和社会造成沉重的经济负担。目前临床主要采用钙剂、维生素D3、双磷酸盐、激素和降钙素等药物进行治疗，但副作用大、费用昂贵。中药抗骨质疏松的疗效在体内外实验都得到了证明，但其成分复杂，具体的分子机制研究很难阐述清楚。因此，对中药单体有效成分进行系统研究并阐明其分子机制就显得尤为重要，也符合中药现代化的要求。本论文正是在这样的启示下，以单体化合物8-异戊烯基柑橘素为研究对象，系统研究了该化合物对骨代谢相关细胞的影响和分子机制。同时用其结构类似物柑橘素进行对比研究，对其活性基团的具体定位和活性部分进行了实验证明。课题实验的第一部分进行了8-异戊烯基柑橘素和柑橘素对成骨细胞的影响及分子机制的研究，分离培养乳鼠颅骨成骨细胞为研究对象。药物干预的第48、72h研究了药物对细胞增殖的影响；分别于药物干预处理后第3、6、9和12d测定细胞碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、Ⅰ型胶原表达量和钙化结节数；于处理后6、12、24、48、72h分别提取细胞总RNA，用Real time RT-PCR法检测成骨细胞微环境相关因子的改变；PCR法和蛋白印迹法对成骨细胞骨性分化和成熟相关基因、蛋白进行检测，研究了其分子机制。实验结果显示：8-异戊烯基柑橘素和柑橘素不促进成骨细胞增殖，但能促进成骨细胞的分化成熟及矿化，8-异戊烯基柑橘素的活性明显强于柑橘素。课题实验的第二部分进行8-异戊烯基柑橘素和柑橘素对骨髓间充质干细胞的影响及分子机制的研究，全骨髓培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞。药物干预的第48、72h检测其对细胞增殖的影响；分别于药物干预并成骨性诱导处理后的第4、8、12和16d测定细胞碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、Ⅰ型胶原表达量和钙化结节数；于处理后6、12、24、48、72h分别提取细胞总RNA，用Real time RT-PCR法检测成骨细胞微环境相关因子的改变；PCR法和蛋白印迹法对成骨细胞骨性分化和成熟相关基因、蛋白进行检测，研究了其分子机制。实验结果显示：8-异戊烯基柑橘素和柑橘素可以显著增强骨髓间充质干细胞的成骨性分化和生物矿化能力，两者相比8-异戊烯基柑橘素的活性明显强于柑橘素。课题实验的第三部分进行8-异戊烯基柑橘素和柑橘素对破骨细胞的影响及分子机制的研究，从乳兔股骨骨髓腔中分离培养得到破骨细胞。药物干预7天后检测了药物对破骨细胞凋亡的影响、对破骨细胞在骨膜片上骨吸收的影响；PCR法和蛋白印迹法对破骨细胞成熟分化相关的基因和蛋白检测，研究了其分子机制。结果显示：8-异戊烯基柑橘素和柑橘素能够通过促进破骨细胞凋亡和抑制破骨细胞分化来抑制破骨细胞的骨吸收作用。两者相比8-异戊烯基柑橘素的抑制骨吸收的活性强于柑橘素。结论：8-异戊烯基柑橘素能够促进成骨细胞和骨髓间充质干细胞的成骨性分化、成熟及矿化，通过抑制破骨细胞成熟和促进破骨细胞的凋亡抑制破骨的骨吸收；8-异戊烯基柑橘素促进骨细胞的调节显著强于柑橘素。

论文目录

摘要

Abstract

英文缩写词表

第1章绪论

1.1 骨质疏松症及其危害

1.2 国内外骨质疏松药物治疗的理论基础

1.3 中药抗骨质疏松作用的作用机制

1.4 8-异戊烯基黄酮类化合物及其特点

1.5 8-异戊烯基黄酮类化合物对骨代谢相关细胞的影响

第2章 8-异戊烯基柑橘素对体外培养成骨细胞的影响及分子机制研究

2.1 材料和方法

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要试剂配制

2.1.5 骨大鼠成骨细胞的分离及培养

2.1.6 大鼠成骨细胞的鉴定

2.1.7 PNG 与 NG 最适作用浓度的筛选

2.1.8 PNG 与 NG 对成骨细胞增殖的影响

2.1.9 PNG 与 NG 对成骨细胞分化成熟的影响

2.1.10 PNG 与 NG 对成骨细胞细胞微环境的影响

2.1.11 对成骨细胞 BMP-2/p38MAPK/Runx2/Osterix 通路的影响

2.2 结果

2.2.1 成骨细胞形态学观察及鉴定结果

2.2.2 不同浓度 PNG 与 NG 对成骨细胞最适作用浓度筛选结果

2.2.3 不同浓度 PNG 与 NG 对成骨细胞增殖的影响

2.2.4 PNG 与 NG 对成骨细胞成骨性分化的影响

2.2.5 PNG 与 NG 对成骨细胞细胞微环境的影响

2.2.6 PNG 与 NG 对 BMP-2/p38MAPK/Runx2/Osterix 通路的影响

2.3 讨论

第3章 8-异戊烯基柑橘素对体外培养骨髓间充质干细胞的影响及分子机制

3.1 材料和方法

3.1.1 实验动物

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 主要试剂配制

3.1.5 大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

3.1.6 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定

3.1.7 PNG 与 NG 对骨髓间充质干细胞增值的影响

3.1.8 PNG 与 NG 对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响

3.1.9 PNG 与 NG 对骨髓间充质干细胞成骨性分化微环境的影响

3.1.10 PNG 与 NG 对骨髓间充质干细胞成骨性分化过程中信号传导通路BMP-2/p38MAPK/Runx2/Osterix的影响

3.2 结果

3.2.1 骨髓间充质干细胞形态学观察及鉴定结果

3.2.2 不同浓度 NG 与 PNG 对骨髓间充质干细胞增殖的影响

3.2.3 PNG 与 NG 对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响

3.2.4 PNG 与 NG 对成骨细胞细胞微环境的影响

3.2.5 PNG 与 NG 对 BMP-2/p38MAPK/Runx2/Osterix 通路的影响

3.3 讨论

第4章 8-异戊烯基柑橘素对体外培养破骨细胞的影响及分子机制研究

4.1 材料与方法

4.1.1 实验动物

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.1.4 主要试剂配制

4.1.5 兔破骨细胞的培养

4.1.6 兔破骨细胞的鉴定

4.1.7 实验分组与药物干预

4.1.8 PNG 与 NG 对破骨细胞活性影响及相关的指标检测

4.1.9 PNG 与 NG 对破骨细胞影响的分子机制研究

4.2 结果

4.2.1 骨髓间充质干细胞形态学观察及鉴定结果

4.2.2 PNG 与 NG 对破骨细胞活性的影响

4.2.3 PNG 与 NG 对破骨细胞相关基因蛋白的影响

4.3 讨论

结论

不足与展望

参考文献

致谢

附录 A：攻读学位期间所发表的学术论文目录

8-异戊烯基柑橘素对骨代谢相关细胞的影响及分子机制研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢