白藜芦醇对脂联素表达和多聚化的调控及机制研究

论文摘要

第一部分白藜芦醇对脂联素蛋白表达和多聚化的影响及Sirt1在调控当中的作用目的：（1）探讨白藜芦醇（Resveratrol, RSV）分别在体内和体外脂肪组织中对脂联素蛋白表达和多聚化的影响；（2）探讨Sirt1在RSV调控脂联素蛋白表达中的作用。方法：（1）体外分化成熟3T3-L1脂肪细胞,分别予不同浓度的RSV干预24小时或50uM RSV干预不同时间后,Western blot检测细胞内脂联素蛋白表达水平,凝胶过滤层析法（Size Exclusion Chromatography, SEC）测定细胞内脂联素多聚化水平；（2）2月龄雌性C57BL6小鼠,分别给予正常饲料或含0.1% RSV饲料喂养14周,分离脂肪组织,匀浆均质后,Western blot检测脂肪细胞内脂联素蛋白表达水平；（3）体外诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,分别予Sirt1抑制剂(（Sirtinol,10 uM）和/或RSV （50 uM）干预,同时设立空白对照组。免疫沉淀法测定PGC-1α蛋白表达和磷酸化水平,Western blot检测细胞内脂联素蛋白表达水平；（4）体外诱导分化成熟的Sirt1-KO/WT MEF细胞,予50uM浓度RSV干预24小时后,Western blot检测细胞内脂联素表达水平。整个试验过程遵循随机化及双盲原则。结果：（1）与对照组相比,RSV处理组3T3-L1脂肪细胞内脂联素高分子量聚体的含量显著升高（P<0.05）,且呈剂量和时间依赖性；（2）与正常饮食饲养组相比,含0.1%RSV饮食饲养组小鼠体内脂肪组织中脂联素蛋白表达显著增加（P<0.05）；（3）Sirtinol预处理不影响RSV刺激的脂联素表达水平的增加。与对照组（WT）细胞相比,RSV处理也同样剂量依赖性地增加了Sirtl-KO MEF细胞中脂联素的蛋白表达水平。结论：RSV可以上调脂肪细胞中脂联素蛋白的表达及多聚化水平。RSV在脂肪细胞中上调脂联素蛋白表达水平主要不依赖Sift1的作用。第二部分DsbA-L在RSV调控脂联素表达和多聚化中的重要作用目的：（1）探讨DsbA-L在RSV调控脂联素表达中的作用；（2）探讨DsbA-L在RSV调控脂联素多聚化中的作用；（3）探讨RSV对DsbA-L及脂联素mRNA转录水平的影响。方法：（1）体外分化成熟3T3-CAR脂肪细胞,腺病毒转染过表达DsbA-L或RNAi抑制DsbA-L表达水平,RSV处理后,Western blot检测细胞内脂联素蛋白表达水平；（2）体外分化成熟3T3-L1脂肪细胞,RNAi抑制DsbA-L表达水平,RSV处理后,凝胶过滤层析法测定细胞内脂联素多聚化水平；（3）RSV处理分化成熟3T3-L1脂肪细胞,实时定量RT-PCR测定细胞内DsbA-L及脂联素mRNA表达水平。结果：（1）RSV处理明显增加了对照组DsbA-L和脂联素的细胞内蛋白表达水平,RNAi抑制DsbA-L表达后,RSV对细胞内脂联素蛋白表达水平及脂联素高分子量聚体含量的刺激增加作用明显消失（P<0.01）；（2）过表达DsbA-L增加了细胞内脂联素的蛋白表达水平,而且在过表达DsbA-L细胞组中,RSV处理未引起细胞内脂联素蛋白表达水平进一步升高；（3）RSV处理明显增加了细胞内DsbA-L mRNA转录水平,但对细胞内脂联素mRNA转录水平没有明显影响（P<0.05）结论：DsbA-L在RSV上调细胞内脂联素的蛋白表达及多聚化水平的调控中起着不可或缺的作用,而且RSV对细胞内脂联素上调的作用主要是直接通过增强细胞内DsbA-L的表达水平达到的。第三部分RSV调控DsbA-L和脂联素信号通路的机制研究一：RSV与PDK1/Akt/Foxo1信号通路目的：（1）探讨RSV与PDK1/Akt/Foxo1信号通路的关系；（2）探讨PDK1/Akt/Foxo1信号通路在RSV细胞内上调DsbA-L和脂联素表达机制中的作用。方法：（1）无血清培养C2C12细胞,RSV预处理后胰岛素刺激10分钟,Western blot及IP测定胰岛素受体的Tyrosine磷酸化水平及Akt在Thr308的磷酸化水平；（2）无血清培养分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,RSV与胰岛素共处理,Western blot测定Akt在Thr308. Ser473以及FOXO1在Ser256的磷酸化水平及蛋白表达水平；（3）PDK1-KO/WT MEF细胞培养成熟后,RSV处理24小时,Western blot检测细胞内Akt在Thr308、FOXO1在Ser256的磷酸化水平及DsbA-L脂联素、PDK1、Akt、FOXO1的蛋白表达水平；（4）体外分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,Akt特异抑制剂AktiVIII预处理,RSV处理后Western blot检测细胞内Akt在Thr308、FOXO1在Ser256的磷酸化水平及DsbA-L、脂联素、PDK1、Akt、FOXO1的蛋白表达水平；（5）分化成熟3T3-CAR脂肪细胞,RNAi转染抑制FOXO1表达水平,RSV处理后Western blot检测细胞内Akt在Thr308、FOXO1在Ser256的磷酸化水平及DsbA-L、脂联素、PDK1、Akt、FOXO1的蛋白表达水平；结果：（1）RSV处理没有明显抑制C2C12细胞胰岛素刺激的胰岛素受体的tyrosine磷酸化,但呈剂量依赖性地抑制了胰岛素刺激的Akt在Thr308上的磷酸化；同时,RSV处理明显抑制了3T3-L1脂肪细胞内Akt在Thr308、FOXO1在Ser256的磷酸化水平；（2）与WT细胞组比较,PDK1-KO MEF细胞组中细胞内DsbA-L的蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；而且有趣的是,RSV还可以进一步明显升高PDK1-KO MEF细胞中DsbA-L的蛋白表达水平（P<0.05）；（3）AktiVIII增加了细胞内DsbA-L和脂联素的蛋白表达水平（P<0.01）,与RSV的共处理可进一步增强这种作用（P<0.05）；（4）与Scramble对照细胞组比较,FOXO1-RNAi抑制FOXO1后,脂肪细胞内DsbA-L和脂联素的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,同样,也明显减弱了RSV刺激增加的细胞内DsbA-L和脂联素的蛋白表达水平（P<0.05）。然而,RSV仍然对FOXO1-RNAi抑制FOXO1后细胞内DsbA-L和脂联素的蛋白表达水平有明显的升高作用（P<0.01）结论：RSV可以抑制PDK1/Akt/Foxo1信号通路,而且对该通路的抑制可能部分参与了其对DsbA-L和脂联素表达的上调。RSV对DsbA-L和脂联素表达的上调作用可能还存在着PDK1/Akt/Foxo1以外的其它机制。第四部分RSV调控DsbA-L和脂联素信号通路的机制研究二：RSV与AMPK信号通路目的：（1）探讨RSV与AMPK信号通路的关系；（2）探讨AMPK信号通路在RSV细胞内调控DsbA-L和脂联素表达机制中的作用。（3）探讨PDK1/Akt/Foxo1信号通路与AMPK信号通路对RSV细胞内上调DsbA-L和脂联素表达机制中的协同作用。方法：（1）分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,用AMPK的特异性抑制剂Compound C预处理一小时后,RSV处理24小时,Western blot测定细胞内AMPK在Thr172的磷酸化水平以及DsbA-L、脂联素和AMPK本身的蛋白表达水平; （2）AMPK-RNAi转染的C2C12细胞及Scramble细胞,RSV处理24小时后Western blot测定测定细胞内DsbA-L的蛋白表达水平；（3）分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,用特异性AMPK激动剂AICAR和RSV共处理,Western blot测定细胞内AMPK在Thr172的磷酸化水平以及DsbA-L、脂联素和AMPK本身的蛋白表达水平；（4）分化成熟的3T3-CAR脂肪细胞,用含FOXO1-RNAi或Scramble RNA腺病毒转染后,Compound C1小时或／和RSV24小时处理,Western blot测定细胞内DsbA-L、脂联素和FOXO1蛋白表达水平。结果：（1）Compound C明显地抑制了RSV刺激的细胞内DsbA-L和脂联素蛋白表达水平（P<0.05）；（2）同样,与C2C12 Scramble细胞比,AMPK-RNAi C2C12细胞中RSV刺激增加的细胞内DsbA-L蛋白表达水平也明显减少（P<0.05）; （3） AICAR显著增加了3T3-L1脂肪细胞内DsbA-L和脂联素的蛋白表达水平,而且,与RSV共处理,AICAR处理没有进一步增加RSV对细胞内DsbA-L和脂联素的蛋白表达的上调作用；（4）Compound C处理部分抑制了Scramble 3T3-L1脂肪细胞中RSV对细胞内DsbA-L和脂联素的蛋白表达水平的刺激增加作用,而在FOXO1-RNAi3T3-L1脂肪细胞中,共处理CompoundC使RSV对细胞内DsbA-L和脂联素的蛋白表达的上调作用消失。结论：AMPK信号通路也参与了RSV对DsbA-L和脂联素上调作用的调节,激活AMPK信号通路和抑制]PDK1/Akt/Foxo1信号通路是RSV对DsbA-L和脂联素的蛋白表达水平上调的主要作用机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 RSV对脂联素蛋白表达和多聚化的影响及Sirt1在调控当中的作用
• 第一章 材料与方法
• 第二章 结果
• 第三章 讨论
• 第二部分 DsbA-L在RSV调控脂联素表达和多聚化中的重要作用
• 第一章 材料与方法
• 第二章 结果
• 第三章 讨论
• 第三部分 RSV调控DsbA-L和脂联素信号通路的机制
• 研究一:RSV与PDK1/Akt/Foxo1信号通路
• 第一章 材料与方法
• 第二章 结果
• 第三章 讨论
• 第四部分 RSV调控DsbA-L和脂联素信号通路的机制
• 研究二:RSV与AMPK信号通路
• 第一章 材料与方法
• 第二章 结果
• 第三章 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果