论文摘要
目的:细胞色素P450酶（Cytochrome P450,CYPs）是一类含有亚铁血红素的超家族酶,能催化广泛化合物的氧化反应。这些酶的重要作用之一就是清除脂溶性外源性化合物,包括环境中的毒物和药物。众所周知,有许多药物能调节CYPs的活性,因此能改变联合服用的其它药物的药代动力学。这就是所谓的代谢水平的药物-药物相互作用（Drug-drug interaction,DDI）。相互作用的结果表现为药物治疗效果被减弱或增高达致死性的毒性作用不等。在这一超家族中,CYP3A参与了临床上约50%药物的代谢,对CYP3A活性的影响将导致临床上出现严重的药物相互作用。在临床实践中,由于患者合并症和合并用药种类多样性以及临床应用的长期性,使发生药物相互作用的可能性也随之增加。辛伐他汀（Simvastatin,SV）是3-羟-3-甲基戊二酸辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂,即通常所说的他汀类（Statins）药物之一,被广泛应用于高血脂和心血管事件的预防与治疗,它是CYP3A4的底物。胺碘酮（Amiodarone,AMD）是目前应用最广泛的有效的抗心律失常药物,主要也经过CYP3A4代谢。曾有体内研究表明胺碘酮增加血浆中辛伐他汀及其代谢产物辛伐他汀酸的药时曲线下面积（ Area under the plasma concentration-time curve,AUC）,但相互作用的主要机制还有待于明确。本研究在人肝微粒体（Human liver microsome, HLM）水平,以辛伐他汀为探针底物,研究胺碘酮对细胞色素3A4（CYP3A4）活性的影响,利用体外的研究来解释临床上观察到的胺碘酮与辛伐他汀的相互作用,从而探讨体内相互作用的可能机制,并预测体内相互作用的可能性。方法:实验分三步:1.应用高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）检测辛伐他汀及其代谢产物。建立体外检测辛伐他汀色谱条件,体外用HLM单独孵育辛伐他汀,确立反应所需HLM的浓度和孵育时间,以保证实验在其线性范围内进行; 2.胺碘酮对CYP3A4抑制作用的研究1)预孵依赖的抑制实验:不同浓度胺碘酮（0-50μM）经HLM及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH）代谢,产生代谢产物后再与辛伐他汀共同孵育,在不同预孵时间（0和30min）下对CYP3A4的抑制,并计算酶活性抑制50%时抑制剂浓度（Half Inihibition Concentration,IC50）;2)预孵时间依赖和浓度依赖实验:不同浓度胺碘酮（0-50μM）在HLM中对CYP3A4的探针底物辛伐他汀代谢的影响。固定胺碘酮浓度,在不同预孵时间（0-20min）下测定辛伐他汀代谢产物量的变化,CYP3A4对辛伐他汀代谢活性用产物峰面积与内标峰面积之比表示,以无抑制剂存在时的活性做对照,两者之比为不同预孵时间下百分比活性,以百分比活性的自然对数对预孵时间作线性拟合,直线的斜率为一个浓度胺碘酮的表观灭活速率（kobs）;依次类推可求出不同浓度（0,2,5,25,50μM）胺碘酮的kobs;3)通过不同浓度抑制剂和抑制剂不同预孵时间下CYP3A4对辛伐他汀代谢活性的变化,探讨两者相互作用的主要途径;3.利用不同浓度下kobs的倒数对抑制剂浓度的倒数进行双倒数作图,计算不可逆抑制（Mechanism-based inhibition,MBI）的两个参数:1/2最大灭活速率时抑制剂浓度（KI）和最大灭活速率常数（kinact）,从而利用方程计算在抑制剂存在的情况下辛伐他汀药时曲线下面积（AUC）的变化倍数,从而预测体内相互作用的可能性。结果:1.胺碘酮经过NADPH等必需因子在HLM体外代谢,即预孵代谢生成产物后,胺碘酮对CYP3A4的抑制明显增强,说明胺碘酮对CYP3A4的抑制具有NADPH依赖性。但经过预孵后,抑制CYP3A4活性的IC50仍大于50μM,说明胺碘酮对CYP3A4的抑制能力较弱,即需要至少50μM以上的胺碘酮才能抑制一半的CYP3A4的活性;2.随着预孵时间的延长,固定浓度胺碘酮对CYP3A4抑制能力增强,说明胺碘酮对CYP3A4的抑制具有预孵时间依赖性;3.固定预孵时间,随着胺碘酮浓度的增加,其对CYP3A4的抑制也随之增强,说明胺碘酮对CYP3A4的抑制具有浓度依赖性;4.NADPH依赖性、预孵时间依赖性和浓度依赖性是不可逆抑制的特征,以辛伐他汀为CYP3A4探针底物的研究中,胺碘酮对CYP3A4的抑制方式为不可逆性抑制;5.利用双倒数作图求得KI为5.098μM, kinact为0.018min-1,并根据方程求出体内胺碘酮与辛伐他汀合用时,辛伐他汀的药时曲线下面积（AUC）会增加0.76-12.63倍,胺碘酮是CYP3A4的轻度-中度不可逆抑制剂。结论:1.胺碘酮的代谢产物对辛伐他汀的代谢的抑制作用比胺碘酮强;2.胺碘酮与辛伐他汀在体内相互作用的主要机制为不可逆抑制,胺碘酮是CYP3A4的轻度-中度抑制剂;3.根据目前临床的用药剂量（辛伐他汀20mg/天）较辛伐他汀40mg/天安全,但胺碘酮与辛伐他汀联合应用仍有可能发生不良反应。