小鼠和山羊胚胎干细胞的分离与培养

论文摘要

近年来,胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs）以其所具有的全能性、多能性、可操作性及可塑性等诸多优点,成为医学和生命科学领域研究的热点问题之一。小鼠胚胎干细胞（mESCs）已在发育生物学、人类疾病和药物开发等研究领域中得到广泛应用,小鼠ESCs建系技术的丰富完善为建立人类和动物ESCs系提供了参照标准和理论依据。本实验以12.513.5d ICR小鼠胎儿制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层,比较了甘油和DMSO分别作为冷冻保护剂对MEF冷冻效果的影响;以3.5dICR小鼠胚胎为实验材料,探讨了胚胎不同发育阶段、血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响。实验结果如下:1.在小鼠胚胎成纤维细胞冷冻时,采用含10%甘油的DMEM溶液作为常规冷冻保护液效果好于含10%DMSO的DMEM溶液,细胞活力分别为0.787,0.728。2. 3.5d的ICR小鼠胚胎大多为囊胚或桑椹胚,接种到MEF饲养层后,以含15%FBS的ES细胞培养液培养,囊胚的贴壁率与ICM增殖率（75.4%,72.8%）均显著高于桑椹胚（57.9%,52.6%）（P<0.05）,且桑椹胚的贴壁及增殖速度都比囊胚缓慢,因此以囊胚进行ICM的分离培养效果更佳。3.以ICR小鼠囊胚为材料,采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率（79.3%,69%）均比含15%KSR、5%FBS+10%KSR的细胞培养液高（42.9%,28.6%;75%,54.2%）,即培养液中添加15%FBS更有利于囊胚贴壁与ICM增殖,添加5%FBS+10%KSR更能满足小鼠ES细胞在传代培养过程中的生长需要,小鼠ES集落最高传至6代。4.在对培养液中添加的因子进行比较时,与无因子的对照组相比,培养液中添加因子对囊胚贴壁、ICM增殖及传代均起到积极作用。添加10ng/mL LIF+ 10ng/mL SCF的效果比单独添加一种因子的效果好,小鼠ES细胞最高传至6代,高于单独添加一种因子的传代数（4代,2代）。5.用含15%FBS的ES细胞培养液分离获得的小鼠ICM分别采用3种传代方法进行传代,传代时采用5%FBS+10%KSR的ESCs培养液。采用差异贴壁法传代效果最佳,最高传至8代,酶消化法传至4代,机械加酶消化法传至6代。6.实验获得了具有典型ES集落形态的ICR小鼠ES细胞,经AKP染色呈阳性。7.本实验对ICR小鼠ES细胞进行悬浮培养获得了类胚体,在体外培养过程中小鼠ES细胞自发分化为成纤维样细胞、上皮样细胞、脂肪样细胞及神经样细胞等,并出现空泡化。目前,关于人及小鼠ESCs建系的研究已有详细的报道,但家畜ESCs的研究依然处于初级阶段,很少有关于家畜ESCs建系的报道。山羊胚胎干细胞（ESCs）和胚胎生殖细胞（EGCs）是生产转基因动物、克隆动物,制备乳腺生物反应器等的理想候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。本实验以3050d的山羊胎儿及68d的山羊囊胚为实验材料,比较了饲养层及生长因子对分离培养山羊ES细胞的影响。实验结果如下:1.实验以机械法分离获得的山羊ICM为材料,对比了MEF、GEF两种饲养层及两种含不同因子的培养液对山羊ES细胞的影响,结果表明采用MEF饲养层ICM增殖率优于GEF饲养层;与对照组相比,培养液中添加LIF及SCF或胰岛素对山羊ICM的贴壁、增殖及传代都有积极影响;以MEF为饲养层,培养液中同时添加LIF和SCF时,培养山羊ES细胞的效果最佳,传至3代。2.实验获得了具有典型ES集落形态的山羊ES细胞,经AKP染色呈阳性。3.实验过程中,山羊ES细胞自分化为成纤维样细胞、上皮样细胞、脂肪样细胞及神经样细胞等。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写与中文对照
• 文献综述
• 一 胚胎干细胞研究概况
• 1.1 胚胎干细胞的概念及研究进展
• 1.1.1 胚胎干细胞的概念
• 1.1.2 胚胎干细胞的研究进展
• 1.2 哺乳动物胚胎干细胞的研究进展
• 1.2.1 小鼠胚胎干细胞的研究进展
• 1.2.2 山羊和绵羊胚胎干细胞的研究进展
• 1.2.3 人类胚胎干细胞的研究进展
• 1.3 胚胎干细胞的生物学特性
• 1.3.1 ES 细胞的全能性和多能性
• 1.3.2 ES 细胞的形态特征
• 1.3.3 ES 细胞的可操作性
• 1.3.4 ES 细胞具有种系传递功能
• 1.3.5 ES 细胞的体外增殖
• 1.3.6 ES 细胞多能性维持和自我更新的分子机制
• 二 胚胎干细胞系的建立
• 2.1 胚胎干细胞原代分离和培养方法
• 2.1.1 全胚培养法
• 2.1.2 ICM 培养法
• 2.1.3 原始生殖细胞培养法
• 2.2 胚胎干细胞传代方法
• 2.2.1 机械法
• 2.2.2 酶消化法
• 2.2.3 机械法与酶消化法相结合
• 2.3 影响胚胎干细胞分离和培养的因素
• 2.3.1 培养基
• 2.3.2 饲养层
• 2.3.3 血清成分
• 2.3.4 生长因子
• 2.3.5 传代方法
• 2.4 胚胎干细胞的鉴定
• 2.4.1 形态学鉴定
• 2.4.2 碱性磷酸酶活性（AKP）
• 2.4.3 胚胎阶段特异性表面抗原的检测
• 2.4.4 全能性基因的检测
• 2.4.5 核型分析
• 2.4.6 体内分化实验
• 2.4.7 体外分化实验
• 2.4.8 嵌合体制备
• 三 胚胎干细胞应用前景及所面临的挑战
• 3.1 胚胎干细胞的应用前景
• 3.1.1 生产克隆动物
• 3.1.2 生产转基因动物
• 3.1.3 研究真核基因的表达和调控
• 3.1.4 细胞、组织和器官的修复和移植治疗
• 3.1.5 发育生物学研究的理想体外模型
• 3.1.6 高效新型药的发现，筛选动物和人类疾病的模型
• 3.2 胚胎干细胞研究所面临的挑战
• 实验部分
• 实验一 小鼠胚胎干细胞的分离与培养
• 前言
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞的生长形态
• 1.2.2 两种冻存液冷冻MEF 的效果
• 1.2.3 解冻后MEF 的生长情况
• 1.2.4 小鼠胚胎的形态及囊胚贴壁情况
• 1.2.5 不同因素对小鼠ES 细胞分离培养与传代的影响
• 1.2.6 小鼠ES 细胞的鉴定结果
• 1.3 讨论
• 1.3.1 两种冻存液的冷冻效果比较
• 1.3.2 不同发育阶段的小鼠胚胎对贴壁率及ICM 增殖率的影响
• 1.3.3 血清含量对小鼠ICM、ESCs 分离与培养的影响
• 1.3.4 生长因子对小鼠ICM、ESCs 分离与培养的影响
• 1.3.5 传代方法对小鼠ESCs 分离与培养的影响
• 实验二 山羊胚胎干细胞的分离与培养
• 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 山羊超排结果
• 2.2.2 饲养层及生长因子对山羊ES 细胞分离与培养的影响
• 2.2.3 山羊ES 细胞的鉴定结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 饲养层对山羊ES 细胞的影响
• 2.3.2 生长因子对山羊ES 细胞的影响
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文