绿色木霉H6-L4在土壤中定殖能力及对香蕉枯萎病原菌的抑制作用

论文摘要

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）引起的香蕉植株维管束病害。在我国香蕉枯萎病的发病也较为广泛。香蕉枯萎病具有发病快、传染迅速而且又很难防治的特点。正因为这种特性也为全世界和本国的香蕉产业带来了巨大的危害。木霉是一种重要的生防真菌,其优点是适应性强、存在范围广泛、广谱高效等,因此木霉在植物病虫害生物防治方面有广泛的应用。绿色木霉H6-L4是由本实验室筛选的有很强拮抗作用的木霉菌。本论文从绿色木霉H6-L4的生物学特性、培养条件的优化、代谢产物的抑菌活性、H6-L4对香蕉枯萎病的诱导抗性作用、H6-L4在土壤中定殖能力、H6-L4的荧光标记、H6-L4盆栽以及小区实验防病效果等方面对绿色木霉H6-L4进行研究,旨在揭示绿色木霉H6-L4对植物病害的生防作用机制,为H6-L4的有效利用奠定基础。（1）通过平板培养、显微镜观察,得出各因素对绿色木霉H6-L4菌丝的影响大小依次是碳源>无机盐>碳氮比>氮源。通过正交试验得出最有利于绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢的培养基组合为：蔗糖20g、硝酸铵8g、硫酸钾1 g、磷酸二氢钾2g、水1000mL,在此条件下培养5d,能使产孢量达到1.67×109cfu/g。绿色木霉H6-L4最适宜的生长温度为28℃,初始pH为6时,H6-L4产生的菌丝干重最大、孢子数量也最多,产孢量可以达到108数量级。同时,H6-L4发酵上清液的抑菌能力在培养时间为5d时达到最强,接菌量为15%、初始pH为6、300C条件下培养后能够发挥最强的抑菌效果,抑菌圈直径均可达到4cm以上。（2）通过发酵培养,比较抑菌圈大小,测定绿色木霉H6-L4代谢产物及其提取物的抑菌活性和稳定性。通过实验得出绿色木霉H6-L4能产生挥发性物质和非挥发性物质都能够抑制香蕉枯萎病原菌的生长。其中非挥发性物质抑制作用相对较强,同时高温灭活处理后的发酵上清液的抑菌活性明显高于经过超声波破壁处理的。绿色木霉H6-L4发酵液的活性成分在80℃以下、pH为6-7即中性偏酸性时抑制效果最强。对用不同溶剂提取的分生孢子提取物的抑菌率方差分析表明,NaOH提取物对香蕉枯萎病病原菌的抑菌率相对较高,为51.71%。（3）通过对绿色木霉H6-L4施用后香蕉苗诱导抗性相关酶活变化进行检测得出,各酶活较对照组均有明显的提高,其中香蕉苗中过氧化物酶（POD）活性提高2.6倍、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性提高2.5倍、过氧化氢酶（CAT）提高2.4倍、超氧化物歧化酶（SOD）提高1倍、多酚氧化酶（PPO）提高2.5倍。同时对香蕉苗根系细胞活力检测的结果表明,绿色木霉H6-L4与根系之间的相互作用可以有效地提高植株的抗病性。（4）通过测定不同条件下绿色木霉H6-L4在土壤中的定殖能力,以及H6-L4拮抗病原菌的盆栽和小区防效,研究绿色木霉H6-L4的定殖能力和防病效果,实验结果表明,绿色木霉H6-L4在4种不同的土壤中均能够定殖,其定殖的程度顺序依次为：沙土>营养土>黄土>菜园土,同时有植株的土壤中绿色木霉H6-L4的定殖情况明显好于没有植株的处理。最有利于绿色木霉H6-L4繁殖的尿素的浓度为1.6%o、芭田世界通复合肥为0.8‰、有机钾宝为6.4‰、奥普尔腐植酸有机矿化活性冲施肥为6.4‰,各处理后H6-L4在土壤中的活菌量最大时均可达到107以上的数量级。蘸根接种法处理对病原菌的防效略高于土壤接种法处理的防效,其防效为87.84%。绿色木霉H6-L4菌液在50倍的稀释液浓度下对病原菌的防治效果达到最高,其防治效果为85.46%；土壤中先施入绿色木霉H6-L4菌液后的防病效果比较好,其防效为75.23%；小区实验的防效并不是很高,处理60天后防病效果仅为42.12%。（5）通过农杆菌介导的绿色木霉H6-L4绿色荧光标记得出,绿色木霉H6-L4的转化子虽然稳定性很高但是转化效率并不是很高,因此还需进一步探索更有利于H6-L4转化的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 香蕉枯萎病概述
• 1.1 香蕉枯萎病的分布
• 1.2 香蕉枯萎病原菌
• 2 木霉的研究概况
• 2.1 木霉菌简介
• 2.2 木霉菌对植物病原菌的拮抗机制
• 2.3 木霉菌在植物病害生防中的研究进展
• 2.4 影响木霉生防能力的环境因子
• 2.5 木霉的定殖及其研究方法
• 2.5.1 木霉在土壤中的定殖
• 2.5.2 木霉在植物叶片上的定殖
• 2.5.3 木霉在植物根部的定殖
• 3 研究目的意义和内容
• 3.1 研究的目的意义
• 3.2 研究内容
• 第一章 绿色木霉H6-L4的生物学特性
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试药品及培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 不同营养条件对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢量的影响
• 1.2.1.1 碳源对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢量的影响
• 1.2.1.2 氮源对H6-L4菌丝生长和产孢量的影响
• 1.2.1.3 碳氮比对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢量的影响
• 1.2.1.4 无机盐和金属离子对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢量的影响
• 1.2.1.5 最佳培养基对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢量的影响
• 1.2.3 接菌量对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢的影响
• 1.2.4 温度对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢的影响
• 1.2.5 初始pH值对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢的影响
• 1.2.6 最适于绿色木霉H6-L4发挥抑菌作用的条件研究
• 1.2.6.1 绿色木霉H6-L4抑菌最佳培养时间
• 1.2.6.2 绿色木霉H6-L4抑菌最佳接种量
• 1.2.6.3 绿色木霉H6-L4抑菌最佳初始pH值
• 1.2.6.4 绿色木霉H6-L4抑菌最佳温度的确定
• 2 结果与分析
• 2.1 不同营养条件对绿色木霉H6-L4菌丝生长和产孢量的影响
• 2.1.1 不同碳源的影响
• 2.1.2 不同氮源的影响
• 2.1.3 不同碳氮比的影响
• 2.1.4 不同无机盐的影响
• 2.1.5 最佳培养基的确定
• 2.2 培养时间的影响
• 2.3 接菌量的影响
• 2.4 培养温度的影响
• 2.5 初始pH的影响
• 2.6 最适于绿色木霉H6-L4发挥抑菌作用的条件研究
• 2.6.1 绿色木霉H6-L4抑菌最佳培养时间
• 2.6.2 绿色木霉H6-L4抑菌最佳接菌量
• 2.6.3 绿色木霉H6-L4抑菌最佳温度
• 2.6.4 绿色木霉H6-L4抑菌最佳初始pH
• 3 讨论
• 第二章 绿色木霉H6-L4代谢产物的抑菌活性
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 挥发性代谢物对病原菌的作用
• 1.2.2 非挥发性代谢物对病原菌的作用
• 1.2.2.1 非挥发性代谢物对病原菌菌丝干重的作用
• 1.2.2.2 非挥发性代谢物对病原菌菌落生长的作用
• 1.2.2.3 非挥发性代谢物胞内物质对病原菌菌落生长的作用
• 1.2.2.4 非挥发性代谢物抑菌作用稳定性的测定
• 1.2.2.4.1 热稳定性
• 1.2.2.4.2 酸碱稳定性
• 1.2.3 分生孢子提取物的抑菌制作用
• 2 结果与分析
• 2.1 挥发性代谢物对病原菌的作用
• 2.2 非挥发性代谢物对病原菌的作用
• 2.2.1 非挥发性代谢物对病原菌菌落生长的作用
• 2.2.2 非挥发性代谢物对病原菌菌丝干重的作用
• 2.2.3 非挥发性代谢物胞内物质对病原菌菌落生长的作用
• 2.2.4 非挥发性代谢物抑菌作用稳定性的测定
• 2.2.4.1 热稳定性
• 2.2.4.2 酸碱稳定性
• 2.3 分生孢子提取物的抑菌制作用
• 3 讨论
• 第三章 绿色木霉H6-L4对香蕉枯萎病的诱导抗性作用
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验香蕉幼苗
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 菌液制备
• 1.2.2 香蕉苗处理以及采样
• 1.2.3 粗酶液的制备
• 1.2.4 酶活的测定
• 1.2.4.1 过氧化物酶（POD）活性测定
• 1.2.4.2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定
• 1.2.4.3 过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 1.2.4.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 1.2.4.5 多酚氧化酶（PPO）活性测定
• 1.2.4.6 酶粗提液及未知样蛋白含量的测定
• 1.2.5 绿色木霉H6-L4对香蕉苗根系细胞活力的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 过氧化物酶（POD）
• 2.2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）
• 2.3 过氧化氢酶（CAT）
• 2.4 超氧化物歧化酶（SOD）
• 2.5 多酚氧化酶（PPO）
• 2.6 绿色木霉H6-L4对香蕉苗根系细胞生活力的影响
• 3 讨论
• 第四章 绿色木霉H6-L4定殖能力以及防病效果
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 绿色木霉H6-L4不同条件下的定殖能力
• 1.2.1.1 绿色木霉H6-L4在无菌土中的定殖能力
• 1.2.1.2 绿色木霉H6-L4在不同土壤中定殖动态研究
• 1.2.1.3 绿色木霉H6-L4在有无植株处理土壤中的定殖能力
• 1.2.1.4 不同肥料对绿色木霉H6-L4定殖的影响
• 1.2.2 绿色木霉H6-L4的盆栽防效
• 1.2.2.1 病原菌不同接菌方法对盆栽防效的影响
• 1.2.2.2 绿色木霉H6-L4菌液不同稀释倍数对盆栽防效的影响
• 1.2.2.3 不同施菌顺序对盆栽防效的影响
• 1.2.3 绿色木霉H6-L4的小区防效
• 2 结果与分析
• 2.1 绿色木霉H6-L4不同条件下的定殖能力
• 2.1.1 绿色木霉H6-L4和病原菌在无菌土中的定殖能力
• 2.1.2 绿色木霉H6-L4在不同土壤中定殖动态研究
• 2.1.3 绿色木霉H6-L4在有无植株处理土壤中的定殖能力
• 2.1.4 不同肥料对绿色木霉H6-L4定殖的影响
• 2.1.4.1 不同浓度的尿素对H6-L4定殖的影响
• 2.1.4.2 不同浓度的芭田世界通复合肥对H6-L4定殖的影响
• 2.1.4.3 不同浓度的有机钾宝对H6-L4定殖的影响
• 2.1.4.4 不同浓度的奥普尔腐植酸有机矿化活性冲施肥对H6-L4定殖的影响
• 2.2 绿色木霉H6-L4的盆栽防效
• 2.2.1 病原菌不同接菌方法对盆栽防效的影响
• 2.2.2 绿色木霉H6-L4菌液不同稀释倍数对盆栽防效的影响
• 2.2.3 不同施菌顺序对盆栽防效的影响
• 2.3 绿色木霉H6-L4的小区防治效果
• 3 讨论
• 第五章 农杆菌介导的绿色木霉H6-L4荧光标记
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 绿色木霉H6-L4抗生素适宜浓度的确定
• 1.2.2 农杆菌的活化和培养
• 1.2.3 菌株的转化
• 1.2.4 转化子的遗传稳定性分析
• 1.2.5 PCR分析
• 1.2.6 表性突变的筛选
• 1.2.6.1 突变株产分生孢子数量的检测
• 1.2.6.2 拮抗能力变异突变株的筛选
• 1.2.7 绿色木霉H6-L4菌株转化前后的生物学异质性
• 1.2.7.1 生长速度差异
• 1.2.7.2 产孢量差异
• 1.2.7.3 酸碱环境的适应性差异
• 1.2.7.4 温度的适应性差异
• 1.2.7.5 抑菌活性差异
• 2 结果与分析
• 2.1 抗生素适宜浓度的确定
• 2.2 木霉转化子的遗传稳定性分析
• 2.3 菌株的转化及荧光稳定性
• 2.4 产孢突变株的获得
• 2.4.1 产孢突变株分生孢子产生数量的变化
• 2.4.2 产孢突变株菌落形态的变化
• 2.4.3 拮抗能力变异突变株的获得
• 2.5 绿色木霉H6-L4菌株转化前后的生物学异质性
• 3 讨论
• 第六章 总结
• 参考文献
• 致谢