论文摘要
[课题背景]前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是男性生殖系统最为常见的恶性肿瘤,其发病率为欧美国家男性恶性肿瘤的第1位和死亡率第2位。我国PCa的发病率虽低于欧美国家,但随着生活方式改变、人口老龄化及前列腺特异性抗原(PSA)广泛应用于筛查,近年来,PCa的发病率呈明显上升趋势。国内一项PSA筛查研究发现,50岁以上男性的前列腺癌发病率为0.78%,提示中国的前列腺癌实际发病率并不低。因此,寻找前列腺癌有效治疗方法已成为一个急待解决的世界性公共卫生问题。生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤,在肿瘤细胞中,复杂糖链的结构发生异常改变,且这种变化与肿瘤侵袭转移密切相关。N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V (N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是一个与肿瘤及肿瘤转移相关的酶,研究表明GnT-V在很多恶性肿瘤中增多,其产物GIcNAcβ1,6Manαl,6结构有利于外链的延伸,已发现该结构与细胞的恶性转化和肿瘤的转移有密切关系。基因治疗是一种有前景的肿瘤治疗手段,RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年来迅速发展起来的一项新的基因功能研究手段,它是利用与靶基因同源的小片段双链RNA(dsRNA),即:siRNA,转染靶细胞,促进靶基因mRNA降解,从而特异性诱导转录后基因沉默。将siRNA所对应的模板DNA双链序列克隆入质粒转染细胞,DNA模板在细胞内转录成小片段发夹状]RNA (shRNA),与化学合成的小干扰RNA (siRNA)具有相同的基因封闭作用,但作用时间可长达2个月,因其特异性和高效性成为当前肿瘤基因治疗的热点。本实验利用RNAi原理和技术,针对前列腺癌中高表达基因GnT-V的shRNA表达质粒,将其转染高转移潜能的人前列腺癌PC-3细胞,观察RNAi对GnT-V基因表达的抑制效应,寻找抑制效率较高的RNAi片段,为寻找有效治疗前列腺癌分子靶向研究中新靶点提供实验依据。[实验方法]1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA质粒的构建及鉴定(1) GnT-V siRNA序列的设计:根据NCBI数据库中GnT-V基因已知序列(NM002410.3)和siRNA设计原则,设计针对GnT-VcDNA的RNA片段,其序列为:GnT-V/1079 sense’GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3’;经Blast检索确认与GnT-V以外的人类已知基因序列无同源性。将其中一对的序列打乱排列,通过Blast分析无同源性超过70%的序列,作为阴性对照干扰序列,序列为:GnT-V/NC sense5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’。由上海吉玛公司采用化学合成方法合成上述siRNA。(2)shRNA转录模板DNA的设计:根据前面设计的siRNA序列,设计模板DNA链,其顺序分别为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop连接序列、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、BamHⅠ酶切位点。(3)质粒pGPU6/GFP/Neo GnT-V的构建及鉴定:先将各组2条模板单链退火处理,再与双酶切后的pGPU6/GFP/Neo质粒连接,构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,利用限制性内切酶BbsⅠ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后,抽提质粒纯化。2、细胞培养与转染人前列腺癌细胞株PC-3在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,37℃、5%CO2湿度下培养,每周传代2~3次。PC-3细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入PC-3细胞。3、干扰效果检测(1)半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GnT-V mRNA表达转染成功后,继续培养PC-3细胞48h后,收集细胞,经Trizo1一步法提取总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA,进行PCR反应。GnT-V上游引物为5’AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC3’,下游引物为5’TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3’,产物长度为555bp。PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,40℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环;最后72℃再延伸10min.以β-actin为内参,上游引物为5’GAMCTACCTTCAACTCCATC3’下游引物为5’CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3’,产物长度为219 bp。以扩增产物3μl在2%琼脂糖凝胶中电泳,摄像后使用Image. Pro Plus 6.0软件进行光密度分析,用GnT-V/β-actin灰度比值作为GnT-V的相对表达水平。(2)蛋白质印迹(Western blot)检测GnT-V蛋白表达转染成功后,继续培养PC-3细胞72h后,每组收集1×107个细胞,经细胞裂解液提取总蛋白并进行定量。取50μg总蛋白进行SDS—PAGE电泳完成后,电转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉的PBST缓冲液封闭PVDF膜。然后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗体(1:200)、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体(1:1000)4℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG(1:400)、HRP标记的羊抗鼠IgG(1:9000),室温下摇动1h,按说明书使用化学发光底物进行显色,成像,底片扫描后使用Image. Pro Plus 6.0软件进行光密度分析,用GnT-V/GAPDH代表GnT-V的相对表达水平。4、GnT-VshRNA对PC-3细胞增殖、粘附及侵袭的影响(1) CCK-8法检测细胞增殖性取各组对数生长期的待测细胞,CCK-8法分析不同时间点(0h、24h、48h、72h、96h)的细胞活力,每个时间点分别检测8个复孔。测量两组的OD450nm值,绘制生长曲线,并计算干扰组的生长抑制率。细胞生长抑制率(IR)=(对照组OD450值—干扰组OD450值)/对照组OD450值×100%.(2)异质粘附实验取各组对数生长期的待测细胞,每组设24个孔。细胞用无血清RPMI1640培养过夜。Matrigel胶50μL/孔铺96孔板,10g/L BSA煮沸13min变性后封闭,按5×103/孔加入细胞悬液,37℃孵育1h。1×PBS冲洗3次,CCK-8法测量各组OD450nm值。(3)趋化运动实验取对数生长期的细胞,用无血清RPMI1640培养过夜。通过24孔趋化小室检测细胞迁移性,趋化因子为10%新生牛血清。结果表示为穿过聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔随机取5个高倍镜视野计数(400×)。(4)划痕愈合实验取对数生长期的待测细胞,细胞接种于包被CollagenⅣ的6孔板,培养至细胞呈现出单层贴壁生长状态。分别在各组单细胞层上划痕,用含10% FBS的培养基继续培养以使划痕愈合。分别于划痕后0h、12h、24h、36 h每个孔取4个视野拍照,观察划痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[(愈合前两侧细胞层距离-愈合后两侧细胞层距离)/愈合前两侧细胞层距离]×100%.(5)细胞侵袭实验取对数生长期的细胞,用无血清RPMI1640培养过夜。通过24孔趋化小室和matrigel胶检测细胞侵袭性.结果表示为穿过matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔随机取5个高倍镜视野计数(400×)。[统计学方法]实验数据以x±s表示,采用SPSS13.0软件进行数据统计分析,两组比较采用t检验,多组比较采用方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。[结果]1、重组体的双酶切及测序鉴定将重组质粒pGPU6/GFP/Neo GnT-V/1079、pGPU6/GFP/Neo GnT-V/NC用BbsⅠ和BamHⅠ双酶切,酶切产物进行电泳检测,发现重组体中已成功插入目的片段。测序鉴定结果与设计序列完全相符,所含目的基因序列准确无误。结果表明GnT-V shRNA及阴性对照shRNA成功构建于pGPU6/GFP/Neo载体上,重组质粒构建成功。2、siRNA的稳定转染质粒pGPU6/GFP/Neo中含有编码GFP的基因,故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。在荧光显微镜下观察,所有转染细胞均发荧光,说明稳定转染成功。3、GnT-V siRNA对PC-3细胞GnT-V在mRNA及蛋白方面表达的影响PC-3 GnT-V/1079组细胞GnT-V基因的表达较PC-3 GnT-V/NC组明显降低,表明转染GnT-V shRNA载体能抑制目的基因mRNA表达。Western blot结果也显示转染GnT-V shRNA载体能抑制GnT-V蛋白表达。Image-Pro Plus 6.0软件分析GnT-V基因mRNA及蛋白的表达水平,按照公式进行计算后显示PC-3GnT-V/1079组mRNA水平的抑制率为76.5%,蛋白水平的抑制率为67%,与PC-3 GnT-V/NC组相比均有统计学意义(P<0.001)。4、GnT-V shRNA对细胞增殖的影响以细胞在不同时间点(0h、24h、48h、72h、96h)的OD450nm值绘制细胞生长曲线,并计算出PC-3 GnT-V/1079的生长抑制率,可见GnT-V shRNA对PC-3细胞增殖呈显著抑制作用,尤以48h为著,与对照组相比均有统计学意义(P<0.001)。5、GnT-V shRNA对细胞粘附性、运动性和侵袭性的影响以Matrigel胶模仿基底膜进行粘附实验,结果显示下调GnT-V表达可增强PC-3细胞的粘附能力(t=—2.361,P<0.05),而显著抑制PC-3细胞的趋化运动性(t=15.057,P<0.001)。划痕实验也显示抑制GnT-V表达显著延长PC-3细胞的愈合时间。用Matrigel胶介导的细胞侵袭实验结果显示,PC-3 GnT-V/1079、PC-3 GnT-V/NC的穿膜细胞数分别为(6.20±1.70)个和(37.90±3.46)个,PC-3 GnT-V/1079组的穿膜细胞数较阴性对照组显著减少(t=36.733,P<0.001),表明下调GnT-V表达可显著抑制PC-3细胞的侵袭能力。[结论]1、靶向GnT-V的shRNA表达质粒可以显著下调人前列腺癌PC-3细胞GnT-V的mRNA和蛋白表达。2、下调GnT-V的表达后,PC-3细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力受到抑制。3、具有较高抑制效率的GnT-VsiRNA序列可能成为治疗前列腺癌的有效靶点。
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相关论文文献
- [1].GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭能力的影响[J]. 广东医学 2010(10)