重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白抗乙肝病毒的药效学及部分机制

论文摘要

慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）是一种严重危害人类健康的病毒性传染病。我国是乙肝病毒（Hepatitis B Virus,HBV）高流行区,一般人群的乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface Antigen,HBsAg）阳性率为9.09%,约有1.1～1.2亿为HBV携带者,其中部分有不同程度的肝细胞受损,并可能发展成肝硬化和肝癌。干扰素（Interferon,IFN）是细胞和机体受到病毒感染,或者受核酸、细菌内毒素和促细胞分裂素等作用后,由淋巴细胞分泌的一种细胞因子,可分为α、β、γ三类。IFN-α具有抗病毒及免疫调节的双重作用,是临床常用的抗HBV药物。目前用于临床的普通IFN-α半衰期只有4～6h,患者不得不接受频繁的皮下注射（疗程至少半年）,但其长期疗效并不确切。重组人白蛋白融合干扰素α-2b融合蛋白（ recombinant human serum albumin-interferon-α-2b fusion protein ,rHSA-IFNα-2b）是运用基因重组技术开发出来的一种新型长效干扰素,其在体内的半衰期显著长于IFNα-2b和聚乙二醇干扰素（Pegylated Interferon,PEG-IFN）。rHSA-IFNα-2b注射频率可以从IFNα-2b的每天一次或每周3次减少到每两周一次,这将极大地方便患者。同时长效干扰素所提供的较为稳定的血药浓度也将提高疗效,降低不良反应。动物实验及临床试验研究已证明rHSA-IFNα-2b可发挥有效的抗丙肝病毒（Hepatitis C Virus,HCV）作用,但是否同样具有抗HBV作用还有待进一步研究。本研究拟通过探索rHSA-IFNα-2b对体外2.2.15细胞（HepG2 2.2.15 cell）HBsAg、HBeAg（Hepatitis B e Antigen）分泌、HBV DNA复制的影响,及对鸭乙型肝炎动物模型的肝功能影响和对鸭乙肝病毒（DHBV）DNA的抑制作用,来系统考察rHSA-IFNα-2b的抗HBV作用,为rHSA-IFNα-2b治疗CHB的临床试验提供依据。IFN-α主要通过激动特异性细胞膜受体来发挥抗病毒作用。当IFN-α与靶细胞表面的特异性受体结合后,通过JAK-STAT信号通路,触发细胞内一系列酶活化,产生一组抗病毒蛋白,包括2’-5’-寡腺苷酸合成酶（2’-5’-oligoadenylate synthetase,2’-5’-OAS）、磷酸二脂酶（phosphodiesterase,PDE）及蛋白激酶（protein Kinase,PK）。OAS可催化2’-5’-寡核苷酸（2’-5’-oligoadenylate,2-5A）合成,激活内源性核酸内切酶,抑制病毒mRNA信息的传递,从而阻止病毒在宿主细胞内繁殖。本研究同时拟通过考察rHSA-IFNα-2b对抗病毒蛋白OAS的影响,及与Jak-Stat通路、p38-MAPK通路的关联,来阐述其发挥抗HBV作用的机制。（一）体外药效学及机制研究:本课题选用2.2.15细胞作乙型肝炎体外模型,首先采用MTT法考察rHSA-IFNα-2b对2.2.15细胞的毒性作用。选择含8个实验浓度梯度rHSA-IFNα-2b（500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9nmol/L）的培养液,培养2.2.15细胞9天后,加入含有400mg/L MTT的培养液孵育4 h,弃MTT液并加入DMSO,用酶标仪测定吸光度（absorbance,A）值,来考察药物对细胞的破坏程度。结果发现,rHSA-IFNα-2b对2.2.15细胞形态仅有轻微的损坏,且细胞破坏率与细胞形态变化无明显关系,TC50>500 nmol/L,远高于其有效剂量。我们选用含三个不同rHSA-IFNα-2b浓度梯度（0.075,0.3,1.2 nmol/L）的培养液来培养2.2.15细胞,每3天更换含有药物的培养液,分别收集第3、6、9天上清液。细胞上清液中的HBsAg、HBeAg采用ELISA法检测,用酶标仪测定其A值,并根据标准品A值折算得出样品浓度。细胞上清液中的HBV DNA浓度通过实时荧光定量PCR测定,最后通过标准品的CT值来计算样品DNA的浓度。实验结果发现,rHSA-IFNα-2b明显抑制HBsAg、HBeAg分泌,其中浓度在0.075～1.2 nmol/L范围内时,其对HBsAg的抑制作用呈现浓度依赖性;rHSA-IFNα-2b能抑制培养上清液中HBV DNA复制,也呈明显浓度依赖性。IFNα-2b与rHSA-IFNα-2b作用无显著性差异。随后,我们用rHSA-IFNα-2b（0.075、0.3、1.2 nmol/L）作用2.2.15细胞3天后,收集细胞并提取总RNA,用RT-PCR方法考察STAT1、ISGF3、2’-5’-OAS的变化;给予JAK抑制剂或p38抑制剂之后1h再给予rHSA-IFNα-2b（0.3 nmol/L）,48h后收集培养上清液,用ELISA法检测培养上清液中的HBsAg,用实时荧光定量PCR检测上清液HBV-DNA,用Western Blot检测2.2.15细胞2’-5’-OAS蛋白的表达。结果表明,rHSA-IFNα-2b作用3天后,2.2.15细胞的OAS表达明显增加,呈现一定的浓度依赖性;STAT1和ISGF3的表达也有所增加,但浓度依赖性不明显。rHSA-IFNα-2b可抑制HBsAg分泌、HBV-DNA复制,增加2’-5’-OAS蛋白表达;p38抑制剂对rHSA-IFNα-2b作用产生轻微影响,JAK抑制剂可产生较大影响,两抑制剂合用可产生更明显影响,但并不能完全阻断rHSA-IFNα-2b的作用。这说明rHSA-IFNα-2b主要通过Jak-Stat通路发挥作用,p38-MAPK通路也起部分作用。（二）体内药效学:本课题选用感染了鸭乙型肝炎病毒的安徽麻鸭作动物模型,用PCR筛选DHBV阳性雏鸭,皮下注射rHSA-IFNα-2b（0.25、0.5、1.0nmol/kg）,每周1次,共4周;选用IFNα-2b作阳性对照,0.2 nmol/kg,每周3次,共4周;停药1周后处死动物,取肝脏做病理切片。用试剂盒检测血清丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、血清总胆红素（total bilirubin,TBIL）的含量,用实时荧光定量PCR检测DHBV DNA拷贝数;对鸭肝脏进行病理检查;并用Western Blot检测肝脏2’-5’-OAS蛋白的表达。结果表明,rHSA-IFNα-2b治疗4周后,鸭血清ALT、AST、TBIL水平明显降低,其中ALT对rHSA-IFNα-2b治疗更为敏感,表现出一定的剂量依赖性; IFNα-2b也能明显降低ALT、AST、TBIL,但ALT在停药7天后出现反跳,而rHSA-IFNα-2b三治疗组无明显反跳。rHSA-IFNα-2b可使鸭血清DHBV DNA拷贝数明显降低,治疗4周后显示明显剂量依赖性,停药1周后未见反跳;而IFNα-2b停药1周后有明显反跳。rHSA-IFNα-2b对DHBV DNA的抑制率明显高于IFNα-2b。鸭肝脏病理检查发现感染DHBV实验鸭肝细胞出现变性、坏死及炎性细胞浸润,而rHSA-IFNα-2b可使肝细胞变性明显减轻;肝脏组织学评分显示rHSA-IFNα-2b肝脏病理改善要明显强于IFNα-2b。rHSA-IFNα-2b还可增加肝脏细胞2’-5’-OAS蛋白表达,呈现剂量依赖性。总之,rHSA-IFNα-2b能有效抑制2.2.15细胞和鸭乙肝动物模型中乙肝病毒的增殖,它主要是通过影响Jak-Stat通路,增加抗病毒蛋白OAS的分泌而实现的;p38-MAPK通路也发挥部分作用。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 实验一:rHSA-IFNα-2b 体外抗乙肝病毒的药效学及机制
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验细胞
• 1.1.2 药物及试剂
• 1.1.3 常用仪器与设备
• 1.2 实验内容与方法
• 1.2.1 药物的细胞毒性实验
• 1.2.2 细胞上清液中HBsAg、HBeAg 的测定
• 1.2.3 细胞上清液中HBV DNA 的测定
• 1.2.4 RT-PCR 检测细胞STAT1、ISGF3、2'-5'-OAS 表达
• 1.2.5 p38 抑制剂、JAK 抑制剂对rHSA-IFNα-2b 作用的影响
• 1.2.6 统计学处理
• 2 结果
• 2.1 rHSA-IFNα-2b 对2.2.15 细胞的毒性作用
• 2.2 rHSA-IFNα-2b 对2.2.15 细胞分泌HBsAg、HBeAg 的抑制作用
• 2.3 rHSA-IFNα-2b 对细胞上清液中HBV DNA 的抑制作用
• 2.4 rHSA-IFNα-2b 对STAT1、ISGF3、2'-5'-OAS 的影响
• 2.5 p38 抑制剂、JAK 抑制剂对rHSA-IFNα-2b 作用的影响
• 3 小结
• 实验二:rHSA-IFNα-2b 体内抗鸭乙肝病毒的药效学
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 药物及试剂
• 1.1.3 常用仪器与设备
• 1.2 实验内容与方法
• 1.2.1 鸭乙肝动物模型制备与筛选
• 1.2.2 动物实验分组及给药
• 1.2.3 血清生化检测
• 1.2.4 荧光定量PCR 检测鸭血清DHBV-DNA
• 1.2.5 肝脏病理检查
• 1.2.6 Western Blot 检测鸭肝脏2'-5'-OAS 蛋白的表达
• 1.2.7 统计学处理
• 2 结果
• 2.1 DHBV 感染率
• 2.2 鸭血清生化检测结果
• 2.3 鸭血清DHBV-DNA 变化
• 2.4 鸭肝脏病理改变
• 2.5 鸭肝脏2'-5'-OAS 蛋白的表达
• 3 小结
• 讨论
• 1 实验模型的选择
• 1.1 HBV 的体外模型
• 1.2 HBV 的动物模型
• 2 药效学研究
• 3 抗HBV 机制的探讨
• 结论
• 本研究的创新点
• 今后工作设想
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢
• 综述
• 参考文献