大豆GmZTL3和GmZTL4基因的克隆与功能分析

论文摘要

在拟南芥中,ZEITLUPE（ZTL）在调控生物钟及光周期开花途径中发挥重要功能。本文通过同源克隆的方法在大豆获得两个大豆ZTL同源基因,分别命名为GmZTL3和GmZTL4,并对其蛋白特性和生理功能进行了较为详细的研究,结果表明GmZTL3及GmZTL4可能具备与拟南芥ZTL相似的功能。主要依据有:（1）生物信息学分析表明,GmZTL3和GmZTL4与拟南芥中ZTL的蛋白同源性高达90%以上,而且包含有三个共同的功能域:LOV、F-Box和Kelch-repeat功能域,功能域中的关键氨基酸表现出高度的保守性,这两个蛋白的LOV功能域的3D结构与AtPhto2 LOV功能域的结晶结构十分类似;（2）利用酵母表达系统对GmZTL3及GmZTL4重组蛋白进行体外诱导表达、纯化并测定其吸收光谱,结果显示GmZTL3及GmZTL4重组蛋白均在蓝光区域及紫外区域产生强烈的吸收峰,这与拟南芥中蓝光受体的光吸收特性十分类似;（3）通过实时荧光定量PCR的方法检测大豆GmZTL3及GmZTL4 mRNA积累情况,发现在GmZTL3和GmZTL4基因在短日照及长日照条件下均没有明显节律表达特性,但是GmZTL3和GmZTL4具有特异的组织器官及发育时期的时空表达模式。例如在成熟的种子及豆荚中存在着较高水平的表达,在营养生长阶段的叶片中表达量不断增加,在开花期的茎及叶柄表达量较高,这种表达模式与拟南芥ZTL相似;（4）通过拟南芥原生质体转化的方法,发现GmZTL3及GmZTL4定位在细胞质及细胞核中,这与AtZTL的亚细胞定位类似;（5）在拟南芥ztl突变体及C24野生型中过表达大豆GmZTL3后,发现过表达植株的莲座叶片数增多和开花时间延迟,这与拟南芥过表达ZTL的植株表型也十分类似。综上所述,大豆GmZTL3及GmZTL4基因与拟南芥ZTL基因相似,它们都编码蓝光受体,并在大豆的各个时期及各器官中发挥作用,尤其在光周期开花途径中,GmZTL3可能作为开花抑制子调控植物开花。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物体内的生物钟
• 1.2 生物钟的核心反馈调控环
• 1.3 生物钟的信号输入途径与信号输出途径
• 1.4 生物钟与植物的生长发育
• 1.4.1 生物钟调控种子萌发
• 1.4.2 生物钟调控幼苗生长
• 1.4.3 生物钟调控逆境响应
• 1.4.4 生物钟调控开花
• 1.5 ZEITLUPE家族基因在生物钟中的作用
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株及载体
• 3.1.3 试剂及仪器
• 3.1.4 实验试剂配制方法
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 目的基因的生物信息学分析
• 3.2.2 DNA提取
• 3.2.3 RNA的提取及纯化
• 3.2.4 cDNA的合成
• 3.2.5 目的基因的克隆
• 3.2.6 重组蛋白的原核诱导表达
• 3.2.7 重组蛋白的真核诱导表达
• 3.2.8 纯化蛋白吸收光谱测定
• 3.2.9 Western-blot检测蛋白的表达
• 3.2.10 实时荧光定量PCR
• 3.2.11 拟南芥原生质体转化方法
• 3.2.12 拟南芥转化
• 4 结果与分析
• 4.1 大豆GmZTLs家族基因的克隆及生物信息学分析
• 4.1.1 大豆GmZTLs家族基因的预测
• 4.1.2 大豆GmZTL3和GmZTL4基因的克隆
• 4.1.3 ZTL家族蛋白的系统进化树分析
• 4.1.4 大豆GmZTL3和GmZTL4LOV功能域的3D结构预测
• 4.2 大豆GmZTL3和GmZTL4蛋白的诱导表达、纯化及吸收光谱的测定
• 4.2.1 重组蛋白的原核诱导表达
• 4.2.2 重组蛋白的真核诱导表达及纯化
• 4.2.3 重组蛋白的吸收光谱测定
• 4.3 大豆GmZTL3和GmZTL4在不同光周期条件下表达节律性分析
• 4.4 大豆GmZTL3和GmZTL4发育时期特异性表达分析
• 4.5 大豆GmZTL3和GmZTL4组织器官特异性表达分析
• 4.6 大豆GmZTL3和GmZTL4蛋白的亚细胞定位
• 4.7 大豆GmZTL3和GmZTL4在拟南芥中的异位表达分析
• 5 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.2 结论
• 参考文献
• Abstract