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NGAL基因在食管癌细胞中的表达调控机制

2020-11-23阅读(327)

NGAL基因在食管癌细胞中的表达调控机制

论文摘要

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其病因与发病机制至今不甚明了。2000年我们在进行HPVE6E7基因协同TPA诱导正常人胚食管上皮细胞癌变研究中发现,NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）基因在人食管上皮细胞癌变中显著过表达,但究竟发挥何种功能当时尚不清楚。近年来国内外同行及我们课题组研究发现,NGAL的蛋白产物具有:保护调节基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9,即明胶酶B,gelatinase B）的活性;作为小分子铁化合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应;在肿瘤细胞中,NGAL的表达不仅具有促进癌细胞侵袭的功能,同时还可能在癌细胞的不良分化中发挥作用。这些进展表明,在不同的病理生理状态或组织细胞时空条件下NGAL的功能表现形式是多样化的。然而迄今为止,NGAL基因的表达究竟由哪些因素控制,目前依然不清楚。这已经成为制约深入揭示NGAL基因功能的瓶颈问题。有鉴于此,考虑到NGAL基因在食管癌细胞中的独特功能表现,本论文以食管癌细胞为对象揭示了NGAL基因的表达调控机制。首先采用PCR（polymerase chain reaction）技术从SHEEC细胞基因组中克隆了NGAL基因5’侧翼转录调控区中不同长度DNA片段-1431-152,将它们分别克隆到pGL3-Basic和pGL3-Promoter载体中,成功构建了一系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGLB-1431152和pGLP-1431152。再根据生物信息学分析结果,针对NGAL基因5’侧翼区特定区段进行嵌套缺失和定点突变,获得了系列缺失子和突变子。然后应用DLR系统研究鉴定了食管癌细胞中调控NGAL基因基础表达的顺式作用元件及其转录因子。研究发现,随着NGAL5’侧翼区的5’端被截短直到-140时,相对荧光素酶活性虽有参差不齐的改变,但整体来说,均明显高于空载体对照pGLB。然而,当-140-79发生缺失时,相对荧光素酶活性迅速下降,接近pGLB水平。这就意味着NGAL5’侧翼区-140-79区段可能存在着调控NGAL基因基础表达的关键元件,即核心启动子区。为了鉴定出NGAL基因核心启动子区,我们将突变子及其相应的非突变质粒分别与pRL-TK共转染,检测相对荧光

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语简表
  • 第1章 绪论
  • 1.1 学术背景
  • 1.2 国内外研究现状
  • 1.2.1 NGAL 的发现
  • 1.2.2 NGAL 的结构特征
  • 1.2.3 NGAL 蛋白在正常组织中的分布
  • 1.2.4 NGAL 的功能
  • 1.2.5 NGAL 的表达调控机制
  • 1.3 本项研究课题的基金来源及相关课题情况
  • 1.4 本项研究课题的研究意义
  • 1.5 研究目标与研究内容
  • 1.5.1 研究目标
  • 1.5.2 研究内容
  • 第2章 NGAL 5'侧翼区报告基因表达载体的构建
  • 2.1 引言
  • 2.2 研究方案和技术路线
  • 2.3 材料和方法
  • 2.3.1 质粒、菌株及细胞系
  • 2.3.2 实验方法
  • 2.4 结果
  • 2.4.1 pGLB 系列表达载体的鉴定
  • 2.4.2 pGLP 系列表达载体的鉴定
  • 2.4.3 pGLB-152系列缺失子的鉴定
  • 2.4.4 pGLB-140系列突变子的鉴定
  • 2.5 讨论
  • 2.6 本章小结
  • 第3章 调控NGAL 基因基础表达顺式作用元件的鉴定
  • 3.1 引言
  • 3.2 研究方案和技术路线
  • 3.3 材料和方法
  • 3.3.1 质粒、菌株及细胞系
  • 3.3.2 实验方法
  • 3.4 结果
  • 3.4.1 NGAL 基因在食管癌细胞系转录水平的表达
  • 3.4.2 NGAL 基因在食管癌细胞系翻译水平的表达
  • 3.4.3 NGAL 基因启动子区在 EC109 细胞中的基础活性
  • -79 区段内'>3.4.4 NGAL 基因核心启动子位于-119-79 区段内
  • 3.4.5 MRF4 可能是调控NGAL 基因基础表达的转录因子
  • 3.5 讨论
  • 3.6 本章小结
  • 第4章 NGAL 基因TPA 反应元件的鉴定
  • 4.1 引言
  • 4.2 研究方案和技术路线
  • 4.3 材料和方法
  • 4.3.1 质粒、菌株及细胞系
  • 4.3.2 实验方法
  • 4.4 结果
  • 4.4.1 NGAL 启动子区的TPA 反应性
  • 4.4.2 NGAL 的合成在EC109 细胞中可被TPA 上调
  • 4.4.3 NGAL 启动子区中TPA 反应元件的分离
  • 4.4.4 EC109 细胞核蛋白与 TPA 反应元件之间的相互作用
  • 4.5 讨论
  • 4.6 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读博士学位期间所发表的学术论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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