棉花乙烯合成关键基因参与细胞伸长发育的功能分析

论文摘要

乙烯（ethylene）是一种植物激素,在植物整个生命周期中起着至关重要的作用,它对植物的生长发育过程如种子萌发、果实成熟、叶片衰老、器官脱落及响应胁迫反应等有广泛的影响。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）基因是乙烯合成途径中的最后一个关键酶,也称为乙烯形成酶（EFE）,许多研究表明,其对于细胞内乙烯的合成起到重要的调控作用,并可以通过促进乙烯产生增强植物耐受胁迫条件的能力。近些年许多的ACC氧化酶（ACO）不断地从不同植物中克隆出来,其表达模式也得到广泛的研究,利用转基因的方法获得的反义植株表现出明显的抑制乙烯合成的特性。棉花是世界性的重要的经济作物,稳定和提高棉花质量,成为提高我国纺织品国际市场竞争力的重要内容。本文从陆地棉中克隆了ACO基因（AC01、AC02和ACO3）,并对其进行了序列比对,生理性状和功能分析。具体结果如下：1、通过PCR反应,从棉花纤维组织cDNA中分别扩增得到GhAC01基因,大小为960bp的特异性片段；GhAC02基因,大小为960bp的特异性片段；GhAC03基因,大小为954bp的特异性片段。测序结果与来自拟南芥、烟草、大豆、绿豆、苹果、黄瓜的ACO基因有较高的同源性。2、构建植物表达载体p35S::GhACO1、p35S::GhAC02和p35S::GhAC03,采用花序浸染法转化拟南芥；用叶盘法转化烟草,卡那霉素筛选转基因植株。获得转基因拟南芥纯合体植株和转基因烟草。3、GUS组织化学分析检测,结果表明,在转基因拟南芥叶片中有很强的GUS活性,茎和根有微量表达。4、通过对转基因拟南芥T2代植株和烟草阳性植株不定根生长发育情况的统计显示,转GhACO基因的植株的不定根数目要明显多于野生型植株。5、利用NaCl和PEG6000对转基因拟南芥T2代植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理,进行相关生理指标检测,结果显示,与野生型拟南芥相比,转GhACO基因拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性显著性增强。6、通过低温和高温对转基因拟南芥T2代植株进行处理,进行相关生理指标检测,结果显示,与野生型拟南芥相比,转GhACO基因拟南芥对低温胁迫和高温胁迫的耐受性显著性增强。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 本论文所涉及的英文缩写词
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 乙烯合成途径中关键酶ACO的研究进展
• 1.1.1 乙烯的生物合成
• 1.1.2 ACC氧化酶是多基因家族ACC氧化酶是由多基因家族编码的
• 1.1.3 ACC氧化酶的结构特点
• 1.1.4 ACC氧化酶的分子克隆
• 1.1.5 ACC氧化酶的表达调控
• 1.1.6 控制乙烯生物合成的基因工程研究
• 1.2 乙烯的生理作用
• 1.2.1 乙烯在植物生长发育中的作用
• 1.2.2 乙烯与不定根的生长
• 1.2.3 乙烯与植物抗盐性
• 1.2.4 乙烯与植物抗旱性
• 1.2.5 乙烯与植物抗寒性
• 1.2.6 乙烯与植物耐热性
• 1.3 乙烯在棉花纤维发育中的作用研究进展
• 1.4 模式植物拟南芥基因组研究进展
• 1.5 本研究的目的及意义
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶及化学试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 常用溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒提取
• 2.2.1.1 试剂盒小提质粒
• 2.2.1.2 中提质粒
• 2.2.2 植物总DNA的提取
• 2.2.2.1 CTAB法提取
• 2.2.2.2 电钻研磨法提取植物总DNA
• 2.2.2.3 快速提取植物基因组DNA
• 2.2.3 以Trizol提取植物总RNA
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.5 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.5.1 农杆菌常规转化
• 2.2.5.2 农杆菌电转化法（在超净工作台内操作）
• 2.2.6 GhACO基因的克隆和植物表达载体的构建
• 2.2.7 从琼脂糖凝胶上回收目的DNA片段
• 2.2.8 质粒DNA的双酶切
• 2.2.9 DNA片段与载体连接、转化及鉴定
• 2.2.10 拟南芥的培养
• 2.2.10.1 直播法
• 2.2.10.2 移栽法
• 2.2.11 花浸染法转化拟南芥
• 2.2.12 农杆菌介导的烟草遗传转化
• 2.2.13 转化子的筛选及检测
• 2.2.14 GUS染色
• 2.2.15 定根数目的测定
• 2.2.16 胁迫和干旱胁迫处理及表型观察
• 2.2.17 低温胁迫处理及表型观察
• 2.2.18 高温胁迫处理及表型观察
• 2.2.19 逆境处理后的拟南芥的生理指标检测
• 第三章 实验结果与分析
• 3.1 GhACO基因的克隆和鉴定
• 3.2 植物过量表达载体的构建与鉴定
• 3.3 拟南芥转基因植株的抗性筛选及PCR检测
• 3.4 转基因拟南芥的GUS组织化学检测
• 3.5 GhACO1-3促进植物不定根的发生
• 3.5.1 GhACO1-3促进拟南芥不定根的发生
• 3.5.2 GhACO1-3促进烟草不定根的发生
• 3.6 转基因拟南芥对于逆境胁迫的耐受性获得显著提高
• 3.6.1 转GhACO1-3基因拟南芥耐受干旱胁迫的能力获得增强
• 3.6.2 转GhACO1-3基因拟南芥耐受盐胁迫的能力获得增强
• 3.6.3 转GhACO1-3基因拟南芥耐受低温胁迫的能力获得增强
• 3.6.4 转GhACO1-3基因拟南芥耐受高温胁迫的能力获得增强
• 3.7 转基因拟南芥在逆境胁迫下的生理指标检测
• 3.7.1 电导率的检测
• 3.7.2 脯氨酸含量的测定
• 3.7.3 丙二醛含量的测定
• 3.8 结论
• 3.8.1 乙烯对不定根发育的作用
• 3.8.2 乙烯在植物逆境胁迫方面的作用
• 3.8.3 转基因拟南芥对于逆境胁迫的生理指标分析
• 第四章 讨论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 乙烯对不定根发育的作用
• 4.1.2 乙烯在植物逆境胁迫方面的作用
• 4.1.3 其他
• 4.2 进一步实验设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介