论文摘要
本实验室前期的工作通过转座子插入突变的方法从中华根瘤菌Sinorhizobiumsp.1128中筛选到了一个自体诱导物合成酶基因traI,它与草木樨中华根瘤菌Sinorhizobium medicae WSM419的LuxI类自体诱导物合成酶（autoinducer synthase）traI的同源性高达99%,将其缺失后发现缺失株仍能产生部分信号分子。而通过基因序列同源性比对分析发现,S.medicae WSM419中共有3个自体诱导物合成酶基因,因此我们推测中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128中还可能存在其它的自体诱导物合成酶基因。以S.medicae WSM419中Smed 1560,Smed 6489基因序列为模板设计引物,通过PCR扩增从Sinorhizobium sp.1128中克隆到一个新的自体诱导物合成酶基因命名为traI2,通过基因同源性比较发现它与Smed1560基因同源性高达99%。将该基因克隆至广宿主载体pYC12中并在E.coli DH5α中异源表达,对大肠杆菌重组菌株的上清液进行AHL活性检测表明:上清液中有AHL活性;TLC显色结果表明:traI2基因在大肠杆菌中至少负责合成两种AHL分子。采用中间片段融合的方法分别获得野生型菌株Sinorhizobium sp.1128与traI基因缺失菌株Sinorhizobium sp.YW1的traI2基因缺失株Sinorhizobium sp.QY1、Sinorhizobium sp.QY2,对上述自体诱导物合成酶基因缺失菌株的上清液进行检测,结果表明:各突变菌株的AHL活性均有不同程度的降低;TLC检测结果表明各突变菌株的AHL分子合成的种类发生改变。将携带有traI2基因的表达载体接合转移至突变株QY1、QY2后,其合成自体诱导物的能力得到恢复。这些结果表明traI2基因确为自体诱导物合成酶基因,它在Sinorhizobium sp.1128中至少负责合成一种自体诱导物分子。通过基因同源性比对还发现在S.medicae WSM419中Smed1560基因的上游有LuxR类蛋白的基因,以该基因序列为模板,通过PCR从Sinorhizobium sp.1128中扩增到了相应的基因并命名为luxR,进行基因同源性比对发现,它与S.medicae WSM419中luxR蛋白基因同源性为100%。将该基因克隆至表达载体pET28（a）中在Ecoli BL21中异源表达可产生相同分子量的蛋白质。为了研究LuxR对traI2基因的调控作用,将luxR的表达质粒与ptraI2-lacZ的质粒共转化到Ecoli MC4100中构建了LuxR与traI2基因相互调控作用的模型,通过菌体显色结果可以看出LuxR对traI2基因的表达有一定的诱导作用,且这种诱导作用不受AI浓度的影响。为了进一步验证这一点,随后又在Sinorhizobium sp.1128中进行traI2基因的转录融合、翻译融合以及在这两种融合菌株中超量表达luxR基因,所得到的菌体显色结果均证实了这一点。将Sinorhizobium sp.1128的野生型菌株与各traI、traI2突变株分别接种宿主植物草木樨进行结瘤实验,结果发现与野生型相比各突变株的有效瘤比率明显下降,说明Sinorhizobium sp.1128的群体感应系统对根瘤菌与宿主植物形成有效共生体系的过程具有调控作用。
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