论文摘要
自上世纪六、七十年代Altman首次报道成年哺乳动物脑内存在神经再生（neurogenesis）以来,人们通过大量的实验研究发现,在成年鸟类、啮齿类、狨猴甚至人类的脑内存在有一种仅具有分化为神经元和胶质细胞潜能的神经前体细胞（neuroprogenitors）,它终生能够生成新的神经元以适应某些生理（如学习、迁徙、应激、幼仔识别）或病理（如脑缺血、抑郁症、精神分裂症、癫痫等）反应。这个现象称为成年脑神经再生。成年脑神经再生主要发生在两个脑区:侧脑室下区（subventricular zone,SVZ）和海马齿状回颗粒细胞下层区（subgranular zone,SGZ）,通称为结构性神经元发生区;每天SVZ区约有30,000个新生细胞沿RMS通路向嗅球迁移,生成中间神经元;而SGZ区约有9,000个新生细胞向颗粒细胞层迁移,生成颗粒细胞。近些年研究还发现,脑内还存在一些区域,如纹状体、皮层、海马CA1区锥体细胞层（通常被称为非神经元发生区）,它们在生理条件下不存在神经再生,但在脑卒中等病理条件下,这些脑区也可发生神经再生。就其过程而言,成年脑神经再生包括神经前体细胞的增殖、迁移、分化、成熟、存活和建立突触环路等多个环节;促进神经再生的因素可通过这些不同的环节来调控成年脑神经再生。近些年来的研究成果表明,成年脑神经再生的研究可能为脑卒中等脑损伤疾病以及抑郁症等精神疾病的治疗带来新的希望。但目前对这些神经前体细胞的生物学特性的认识以及对成年脑神经再生的细胞和分子机制还不清楚?甘氨酸受体是五聚体型配体门控的Cl-通道,为α亚基组成的同聚体或2α:3β组成的异聚体,其中α亚基有四种亚型（α1-α4）,β亚基只有一种亚型,研究表明这些亚型的结构存在着高度的序列同源性。但,有趣的是,甘氨酸受体的组成及其亚型分布随着个体发育阶段的不同而发生着变化:新生个体的甘氨酸受体通常是由α2组成的同五聚体,主要存在突触外;成熟个体的甘氨酸受体是由α1和β组成的异五聚体,主要存在突触内。α2亚基在出生前的中枢神经系统中高表达,出生后表达水平逐渐下降,成年后仅在海马和丘脑等脑组织中有表达。这些研究表明,甘氨酸受体α2亚型可能与细胞的发育相关。近年来,有大量的研究表明,甘氨酸受体的α2亚型在神经元的发育中发挥了重要作用。1998年Flint等报道从未成熟的皮层神经元释放的Taurine通过作用于突触外甘氨酸受体,可影响皮层的发育,皮层的重量和形态都发生了改变。2004年Young和Cepko敲除视网膜的甘氨酸受体α2亚基,从而减少了神经前体细胞向视杆细胞的分化。2006年Pierre Drapeau靶向性的敲除斑马鱼胚胎的甘氨酸受体α2亚基,破坏了其运动节律的形成,采用免疫组织化学的方法发现是由于脊髓中间神经元的数目减少了。这些研究结果表明突触外甘氨酸受体可以调控神经元的发育。我们以往的研究结果也表明,成年神经前体细胞表达甘氨酸受体α2亚基;甘氨酸受体的阻断剂士的宁能够减少海马SGZ区新生细胞的数目,而激动剂能够增加SGZ区新生细胞的数目,提示甘氨酸受体可能参与了成年神经前体细胞的调控。本研究的目的是在培养的成年神经前体细胞上进一步证明甘氨酸受体对成年神经前体细胞的调控作用及其可能的机制。研究成年神经前体细胞的调控机制,最重要的一个前题条件就是建立成年神经前体细胞的体外培养技术平台,但成年大鼠神经前体细胞的体外培养一直都是一件比较棘手的事情。目前国际上主要有两种培养方法:悬浮法和贴壁法。Gage FH小组的贴壁培养法已被国际同行广泛认可。本研究的主要目的是:1、建立成年神经前体细胞的体外培养体系,并鉴定其纯度;2、研究甘氨酸受体各亚基在成年神经前体细胞上的表达,尤其是α2亚基的表达情况;3、研究甘氨酸受体的阻断剂士的宁（Strychnine）、印防己毒素（Picrotoxin）和激动剂牛磺酸（Taurine）对成年神经前体细胞增殖的影响,探讨甘氨酸受体α2亚型对成年神经前体细胞的调控作用。本实验培养的成年神经前体细胞,利用无血清培养技术,在添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的rat neural stem cell expansion medium培养液中进行培养。在培养的过程中发现,成年神经前体细胞体积较小,呈圆形,周围长有细小突起。采用细胞免疫荧光法对培养的成年神经前体细胞进行鉴定,呈巢蛋白（nestin）阳性的细胞高达99%。甘氨酸受体各亚基的表达情况:采用细胞免疫荧光标记技术和RT-PCR方法,证明了培养的成年神经前体细胞上仅表达甘氨酸受体α2亚基,不表达α1和α3亚基。甘氨酸受体对成年神经前体细胞调控作用的研究:把单细胞悬液接种于经PLL包被的培养板上,加入不同浓度的Strychnine、Picrotoxin、Taurine处理46小时,再加入5umol/L的BrdU作用2小时后,采用BrdU免疫荧光标记技术标记分裂的细胞,计数BrdU/DAPI双阳性细胞的数目。2.5uM Strychnine组、5uMStrychnine组、10uM Strychnine组、20uM Strychnine组BrdU阳性细胞数的比例分别为control组的88.75%、86.66%、81.63%、80.39%,其中5、10、20uM Strychnine组与control组比较有统计学意义。5uM Picrotoxin组、10uM Picrotoxin组、20uMPicrotoxin组、40uM Picrotoxin组BrdU阳性细胞数的比例分别为control组的104.32%、88.2%、73.77%、66.84%,其中10、20、40 uM Picrotoxin组与control组相比有统计学意义。200uM Taurine组、600uM Taurine组、1mM Taurine组BrdU阳性细胞数的比例分别为control组的98.21%、92.97%、100.3%,各组与control组相比均没有统计学意义。结果显示Strychnine、Picrotoxin可抑制成年神经前体细胞的增殖,且呈浓度依赖性。以上实验结果表明,培养的成年神经前体细胞上表达有甘氨酸受体α2亚基,且甘氨酸受体的阻断剂Strychnine、Picrotoxin可以抑制成年神经前体细胞的分裂增殖,提示甘氨酸受体α2亚型可能参与成年神经前体细胞增殖的调控。
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标签：成年神经前体细胞论文; 甘氨酸受体亚基论文; 细胞增殖论文;