果胶酶高产菌株的选育及其应用

论文摘要

本文应用代谢控制发酵的基本原理,对黑曲霉PG-1（Aspergillus niger PG-1）进行逐级诱变处理,得到一株高产菌株A.niger GJ-2,并进行了发酵条件优化、混菌发酵、果胶酶的纯化和酶学性质的研究,最后对果胶酶的应用进行了研究,主要结论如下:出发菌株A.niger PG-1的果胶酶产量为312.5 U/mL,利用紫外和亚硝基胍对其进行诱变处理,得到一株高产菌株A.niger GJ-2,在未经优化的条件下果胶酶产量为441.2 U/mL,酶活提高41.2%。对菌株A.niger GJ-2进行产酶培养基和发酵条件的优化,得出最佳的产酶培养基为:橙子皮29.2 g/L;麸皮32.8 g/L;硫酸铵10 g/L。最佳发酵条件为:发酵周期72 h;种龄24 h;接种量4%;发酵温度36.3℃。在此优化的条件下果胶酶的产量为556.5 U/mL。并研究了黑曲霉GJ-2和酒精酵母J-1的混菌发酵,得出酒精酵母的最佳接入时间为12 h,最佳接入量为5 mL/250 mL,在此条件下果胶酶酶活达到586.9 U/mL,比出发菌株提高87.8%。经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析得到了电泳纯的果胶酶,其分子量大约为35 KDa,pI大约为3.84。最终电泳纯的果胶酶的比酶活为13478.0 U/mg,纯化倍数为21.1,回收率为19.7%。对果胶酶的酶学性质进行研究,发现其最适作用pH为4.6;最适作用温度为50℃;在pH 2.6-5.6之间有较好的稳定性,相对酶活都保持在80%以上;在50℃处理60 min相对酶活仍达到76.8%,具有较好的热稳定性;当金属离子终浓度为1 mmol/L时,具有激活作用的金属离子为K+、Na+、Fe2+、Cu2+、Mg2+、Zn2+和Ca2+,具有抑制作用的金属离子为Ba2+、Mn2+、Al3+和Fe3+;当金属离子终浓度为5 mmol/L时,具有激活作用的金属离子为Na+、Fe2+、Cu2+、Mg2+和Ca2+,具有抑制作用的有K+、Zn2+、Ba2+、Mn2+、Al3+和Fe3+;以果胶酸为底物,在最适作用pH和温度条件下测得果胶酶的动力学参数:Km=28.4 mg/mL,Vmax=169.5 mg/（mL·min）。利用粗酶液酶解橙子皮,得出最佳的果胶酶量与橙子皮的比例为:550 U/g橙子皮;酶解时间为18 h;最佳酶解温度为50℃;最佳酶解pH为4.0左右。在此条件下,本实验最大可得到的酶解液糖浓度为95.9 g/L,预处理去除大部分柠檬油精的条件下乳酸产量为75.2 g/L;并发现对于本实验用到的干酪乳杆菌G-04（Lactobacillus casei G-04）来说可发酵性糖为鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖和木糖;不可发酵性糖为阿拉伯糖和半乳糖醛酸。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 果胶酶简介
• 1.2 果胶酶的分类及其作用机理
• 1.3 国内外研究进展
• 1.4 国内酶制剂行业生产概况
• 1.5 果胶简介
• 1.6 果胶酶在工业中的应用
• 1.7 产果胶酶的微生物
• 1.8 果胶酶纯化
• 1.9 立题背景和研究意义
• 1.10 本课题的主要研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养方法
• 2.2.2 橙子皮的制备
• 2.2.3 粗酶液的提取
• 2.2.4 诱变方法
• 2.2.5 筛选方法
• 2.2.6 果胶酶纯化方法
• 2.2.7 果胶酶酶学性质的研究
• 2.2.8 果胶酶酶活的测定方法
• 2.2.9 总糖的测定
• 2.2.10 蛋白质浓度的测定方法
• 2.2.11 果胶酶的应用
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 果胶酶高产菌株的筛选
• 3.1.1 最佳诱变时间的确定
• 3.1.2 果胶酶产生菌的选育结果
• 3.1.3 果胶酶高产菌株的选育谱系
• 3.1.4 果胶酶产生菌A.niger GJ-2 遗传稳定性的研究
• 3.1.5 黑曲霉的形态学观察
• 3.2 产酶培养基及发酵条件的优化
• 3.2.1 不同碳源对果胶酶产量的影响
• 3.2.2 不同氮源对果胶酶产量的影响
• 3.2.3 麸皮对果胶酶产量的影响
• 3.2.4 无机盐对果胶酶产量的影响
• 3.2.5 果胶酶发酵周期的确定
• 3.2.6 种龄对果胶酶产量的影响
• 3.2.7 接种量对果胶酶产量的影响
• 3.2.8 温度对果胶酶产量的影响
• 3.2.9 响应面（RSM）实验设计
• 3.2.10 混菌发酵对果胶酶产量的影响
• 3.3 果胶酶纯化结果
• 3.3.1 硫酸铵分级沉淀条件的确定
• 3.3.2 DEAE-FF 层析结果
• 3.3.3 Superdex G-75 层析结果
• 3.3.4 电泳验证
• 3.3.5 果胶酶分离纯化结果
• 3.4 果胶酶的酶学性质
• 3.4.1 果胶酶作用的最适pH
• 3.4.2 果胶酶作用的最适温度
• 3.4.3 果胶酶的 pH 稳定性
• 3.4.4 果胶酶的热稳定性
• 3.4.5 金属离子对果胶酶酶活的影响
• 3.4.6 果胶酶的动力学参数
• 3.5 果胶酶的应用
• 3.5.1 酶液稀释倍数和酶解时间的确定
• 3.5.2 酶解最佳温度的确定
• 3.5.3 酶解最佳 pH 的确定
• 3.5.4 柠檬油精对乳酸发酵的影响
• 3.5.5 发酵前后单糖的比较
• 3.6 结论
• 3.7 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文