兽医微生物资源标准化平台中PRRSV和CDV的分离鉴定及保存

论文摘要

兽医微生物菌种资源标准化平台建设是国家自然科技资源共享平台的一个重要组成部分。其目的旨在建设兽医微生物资源的信息互通、以共享为核心的制度体系,以及培育专业化技术管理人才。本实验为国家兽医微生物菌种资源标准化菌种收集的一个组成部分。作者分别对山东收集的一例PRRSV可疑病料和北京收集的两例CDV可疑病料进行处理,最终分离得到PRRSV病毒一株,命名为TA-2;CDV两株,分别命名为CAU-1、CAU-2。采集山东地区的疑似PRRS的病猪病料—肺、肺门淋巴结、脾脏和脑组织,碾磨破碎后,无菌条件下分别将其攻毒至生长良好的MARC-145细胞（含飞片）,并逐日观察,发现在第3d后出现明显CPE;第5d后MARC-145细胞出现明显凋亡,并从细胞培养瓶脱落;第7d时,部分培养瓶内细胞出现空斑现象。此时取出细胞飞片进行IFA检测。在暗室内与PRRSV FITC荧光抗体作用,然后荧光显微镜下可发现部分样品会出现绿色荧光。另外将出现CPE的细胞裂解提取RNA后,进行RT-PCR检测。PCR产物电泳后染色显像系统观察,可见有与目的片段一致的条带。最后综合以上结果可确定,该病猪确诊为PRRSV。将分离得到的PRRSV命名为TA-2株。CDV的分离来自中国农业大学动物医院的两只疑似犬瘟热患狗。将两只狗解剖后发现存在着不同程度的肝、肾、肺病变,镜下发现神经系统也出现一定病变:脑神经细胞肿胀,细胞变圆,并有卫星现象的形成。将无菌采取的病料攻毒致生长良好的VERO和MDCK细胞中,逐日观察可见明显CPE的出现。分别对临床病料和攻毒后的细胞进行RT-PCR检测,均得到阳性结果;将细胞培养扩增后的CDV通过蔗糖密度梯度离心后进行电镜观察,但结果并不理想;对细胞进行H.E.染色光镜观察,在细胞攻毒2天后细胞浆出现空泡,并有噬酸性胞浆包涵体。综合以上结果,可以确诊两只犬死前均患有犬瘟热。并得到两株CDV,分别命名CAU-1、CAU-2。综上所述,通过运用组织病理学检测方法、病毒的细胞培养和分离、荧光抗体技术和RT-PCR检测方法对病毒进行鉴定,并成功采用低温冻干保存法对鉴定的毒株进行保存。本实验的顺利完成不仅丰富了兽医微生物菌（毒）种库资源,而且为这两种病毒进一步的分子生物学研究和临床检测技术开发奠定了一定的基础。

论文目录

• 英文缩略表
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• 引言
• 一.兽医微生物菌种资源标准化平台建设的目的
• 二.兽医微生物菌种资源标准化平台建设的意义
• 第一部分 猪繁殖与呼吸综合征 TA - 2 株的分离鉴定及保存
• 文献综述
• 1. 病原
• 2. 发病机理及损伤机制
• 2.1 发病机理
• 2.2 损伤机制
• 3. 流行病学
• 4. 诊断方法研究进展
• 5. 疫苗的开发及应用前景
• 实验部分
• 实验一 病毒的培养与分离
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 试验设备及耗材
• 1.1.3 试验所用溶液的配制
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.1.1 细胞复苏
• 1.2.1.2 细胞换液，传代与冻存
• 1.2.2 细胞攻毒
• 1.2.2.1 组织病料的处理
• 1.2.2.2 细胞攻毒
• 1.2.2.3 TCID50的测定
• 1.3 结果及分析
• 实验二 直接荧光抗体方法检测
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验病料
• 2.1.2 试验设备及耗材
• 2.1.3 试验所用溶液的配制
• 2.2 试验方法
• 2.3 结果及分析
• 实验三 RT-PCR 方法检测
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 试验病料
• 3.1.2 试验设备及耗材
• 3.1.3 试验所用溶液的配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 RNA 提取
• 3.2.2 RT-PCR
• 3.2.2.1 反转录获得cDNA
• 3.2.2.2 基因的PCR 扩增
• 3.3 结果及分析
• 实验四 病毒的冻干保存
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 设备与耗材
• 4.1.3 试剂的配制
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 病毒的收集及保存
• 4.2.2 种毒的活力及含量测定
• 4.2.3 种毒的特异性测定
• 4.3 结果及分析
• 5 讨论
• 第二部分 犬瘟热病毒CAU-1,2株的分离鉴定及保存
• 文献综述
• 1. 病因学
• 2. 发病机理
• 3. 症状
• 4. CDV 分离鉴定与诊断
• 5. 防治措施
• 实验部分
• 实验一 病理学观察
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验设备及耗材
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 病犬的临床检查
• 1.2.2 病理组织的获取
• 1.2.3 病理切片的制作
• 1.3 结果及分析
• 1.3.1 犬A的病理学变化
• 1.3.2 犬B的病理学变化
• 实验二 细胞的培养与病毒分离
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验设备及耗材
• 2.1.2 试验所用试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 细胞的复苏
• 2.2.2 细胞换液，传代与冻存
• 2.2.3 病料的处理
• 2.2.4 MDCK 细胞，VERO 细胞攻毒
• 2.2.4.1 细胞攻毒
• 2.2.4.2 TCID50的测定
• 2.2.4.3 细胞传代
• 2.2.4.4 细胞的收集
• 2.3 结果
• 实验三 CDV的RT-PCR方法检测
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 RT-PCR方法检测组织中的CDV
• 3.2.1.1 组织中病毒RNA 的提取
• 3.2.1.2 RNA 的反转录
• 3.2.1.3 PCR 扩增
• 3.2.2 RT-PCR方法检测细胞内的CDV
• 3.2.2.1 RNA 的提取
• 3.2.2.2 RT-PCR 反应
• 3.3 结果及分析
• 3.3.1 RT-PCR 检测组织中 CDV 结果
• 3.3.2 RT-PCR 检测细胞中CDV 结果
• 实验四 细胞攻毒后的电镜观察及病毒包涵体检查
• 4.1 试验材料
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 细胞攻毒后的电镜观察
• 4.2.2 病毒包涵体检查
• 4.3 结果及分析
• 4.3.1 电镜观察结果
• 4.3.2 细胞病毒包涵体检查结果
• 实验五 病毒的冻干保存
• 5.1 材料
• 5.1.2 设备与耗材
• 5.1.3 试剂的配制
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 病毒的收集及保存
• 5.2.2 种毒的含量及活力测定
• 5.2.3 种毒的特异性测定
• 5.3 结果及分析
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 发表文章及科研成果