产1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建及其转化甘油的研究

论文摘要

1,3-丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一,其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1,3-丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法,由于从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇还存在产物浓度低、生产周期长和转化率低等问题,目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此,利用基因工程技术构建高产菌株备受国内外研究者青睐,被认为是今后的发展方向;本研究的目的是构建新型好氧发酵基因工程菌,提高1,3-丙二醇的产量或转化率,为实现微生物法工业化生产1,3-丙二醇打下基础。本研究首次利用PCR方法从从大肠杆菌中克隆1.16 kb的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD及2.80 kb来源于弗氏柠檬杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB,构建了重组菌E. coli JM109（pUCtac-dhaB-yqhD）。并对重组菌E. coli JM109、E. coli JM109（pEtac-yqhD）、E. coli JM109（pUCtac-dhaB）、E. coli JM109 （pUCtac -dhaB-dhaT）、E. coli JM109（pUCtac-dhaB-yqhD）及C. freundii好氧发酵甘油生产1,3-丙二醇的性能进行了初步考察。结果表明,在E. coli JM109中分别只引入甘油脱水酶dhaB基因或1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶yqhD基因得到的重组菌E. coli JM109（pEtac-yqhD）及E. coli JM109（pUCtac-dhaB）均不能利用甘油合成1,3-丙二醇,只有在E. coli JM109中同时引入dhaB基因和yqhD基因时才能利用甘油转化为1,3-丙二醇,进一步证实1,3-丙二醇氧化还原酶的同工酶可在大肠杆菌体内代替1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇。在含甘油50 g/L的发酵培养基中,重组菌E. coli JM109（pUCtac-dhaB-yqhD）经IPTG诱导后的1,3-丙二醇产量为28.0 g/L,而E. coli JM109 （pUCtac-dhaB-dhaT） 1,3-丙二醇的产量为8.2 g/L。1,3-丙二醇氧化还原酶的同工酶代替1,3-丙二醇氧化还原酶（编码基因dhaT）催化3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇的效率明显提高,然而重组质粒pUCtac-dhaB -yqhD需经IPTG诱导才能表达外源基因,相对工业化生产而言,IPTG较为昂贵,因此解决诱导体系的问题显得尤为重要。本研究采用温控表达载体pHsh构建了产1,3-丙二醇重组菌E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD）,并对重组菌E. coli JM109 （pUCtac-dhaB-yqhD）和E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD）发酵生产1,3-丙二醇的性能进行了初步考察。结果表明,温度诱导与IPTG诱导相比1,3-丙二醇的产量无显著差别,在含甘油50 g/L的发酵培养基中,重组菌E. coli JM109（pUCtac-dhaB -yqhD）与E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD）经诱导后1,3-丙二醇的产量分别为28.4 g/L及26.5 g/L。因此,利用温控载体构建产1,3-丙二醇重组菌有利于降低1,3-丙二醇的生产成本。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 1,3-丙二醇的性质及应用领域

1.2 1,3-丙二醇的生产及市场情况

1.3 1,3-丙二醇的生产方法

1.4 微生物发酵法生产1,3-丙二醇的研究进展

1.4.1 生产菌种

1.4.2 1,3-丙二醇生物合成途径

1.4.3 1,3-丙二醇生物合成途径中的关键酶

1.4.4 基因工程研究

1.5 底物和产物对细胞生长抑制作用的研究

1.5.1 底物和产物对细胞生长的抑制作用及其与代谢的关系

1.5.2 包埋法在提高重组菌耐受性方面的应用

1.6 展望

1.7 立题意义和本论文的研究内容

1.7.1 立题意义

1.7.2 研究内容

参考文献

第二章产1,3-丙二醇重组菌 E. coli JM109（pUCtac-dhaB-yqhD）的构建

2.1 材料与方法

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 主要仪器

2.1.3 工具酶和试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 分子克隆技术

2.1.6 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 分析

2.1.7 酶活力测定方法

2.1.8 E. coli JM109（pUCtac-dhaB-yqhD）质粒稳定性分析

2.1.9 重组菌发酵实验

2.2 结果与讨论

2.2.1 含甘油脱水酶基因dhaB 的重组质粒pUCtac-dhaB 的构建

2.2.2 甘油脱水酶基因dhaB 的核苷酸序列分析

2.2.3 含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD 的重组质粒pEtac-yqhD 的构建

2.2.4 1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD 的核苷酸序列分析

2.2.5 重组质粒pUCtac-dhaB-yqhD 的构建

2.2.6 重组菌全细胞蛋白 SDS-PAGE 电泳分析

2.2.7 酶活力分析

2.2.8 E. coli JM109（pUCtac-dhaB-yqhD）质粒稳定性分析

2.2.9 重组菌发酵验证实验

2.3 本章小结

参考文献

第三章产1,3-丙二醇重组菌 E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD）的构建

3.1 材料与方法

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 培养基

3.1.3 工具酶和试剂

3.1.4 主要仪器

3.1.5 培养方法

3.1.6 分子克隆技术

3.1.7 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 分析

3.1.8 酶活力测定方法

3.1.9 E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD）质粒稳定性分析

3.1.10 重组菌发酵实验

3.2 结果与讨论

3.2.1 含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD 的重组质粒pHsh-yqhD 的构建

3.2.2 重组质粒pHsh-dhaB-yqhD 的构建

3.2.3 酶活力分析

3.2.4 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析

3.2.5 E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD）质粒稳定性分析

3.2.6 重组菌初步发酵实验

3.2.7 维生素812 对E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD）发酵结果的影响

3.3 本章小结

参考文献

第四章甘油脱水酶激活因子的编码基因dhaG 和dhaF 的克隆及与pHsh-dhaB-yqhD 的串联表达

4.1 材料与方法

4.1.1 菌株和质粒

4.1.2 培养基

4.1.3 工具酶和试剂

4.1.4 主要仪器

4.1.5 培养方法

4.1.6 分子克隆技术

4.1.7 重组质粒pHsh-yqhD-dhaG-dhaF-dhaB 的构建

4.1.8 酶活力测定方法

4.1.9 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析

4.1.10 E. coli JM109（pHsh-dhaB-dhaG-dhaF -yqhD）质粒稳定性分析

4.2 结果与讨论

4.2.1 重组质粒pHsh-yqhD-dhaG 的构建

4.2.2 重组质粒pHsh-yqhD-dhaG-dhaF 的构建

4.2.3 重组质粒pHsh-yqhD-dhaG-dhaF-dhaB 的构建

4.2.4 甘油脱水酶激活因子编码基因dhaG 与dhaF 的核苷酸序列分析

4.2.5 酶活力分析

4.2.6 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析

4.2.7 E. coli JM109（pHsh -dhaB -dhaG-dhaF-yqhD）质粒稳定性分析

4.3 本章小结

参考文献

第五章重组菌 E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD-dhaG-dhaF）发酵培养基优化

5.1 材料与方法

5.1.1 菌株

5.1.2 培养基和培养条件

5.1.3 Box-Behnken 中心组成实验设计优化培养基组成

5.2 结果与讨论

5.2.1 初始甘油浓度对重组菌发酵的影响

5.2.2 酵母膏浓度对重组菌发酵的影响

5.2.3 磷酸二氢钾浓度对重组菌发酵的影响

12 浓度对重组菌发酵的影响'>5.2.4 维生素B₁₂浓度对重组菌发酵的影响

5.2.5 Box-Behnken 实验设计优化重组菌的发酵培养基

5.2.6 5 L 发酵罐上重组菌的发酵特性

5.3 本章小结

参考文献

第六章重组菌 E. coli JM109（pHsh-dhaB-yqhD-dhaG-dhaF）的固定化研究

6.1 材料与方法

6.1.1 菌株

6.1.2 培养基

6.1.3 主要试剂

6.1.4 主要仪器

6.1.5 发酵方法

6.1.6 检测方法

6.2 结果与讨论

6.2.1 固定化细胞诱导时间的确定

6.2.2 正交优化试验结果与分析

6.2.3 营养因子对重组菌固定化发酵生产1,3-丙二醇的影响

6.2.4 重组菌固定化细胞的稳定性

6.3 本章小结

参考文献

主要结论

创新点

攻读博士学位期间发表的论文

致谢

主要符号对照表

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