SARS病毒N蛋白特异性抗体的制备及其B细胞表位研究

论文摘要

严重急性呼吸道症候群（severe acute respiratory syndrome, SARS）是人类21世纪遭受的一种新型烈性传染病。它严重地危害了人们的身体健康,给社会的经济发展带来了巨大的影响。据报道,截至到2003年7月11日,全球有32个国家和地区,约8437人感染了SARS病毒,其中813人死亡。SARS病毒的致死率大约为10.5%。SARS病毒感染,因起病急、传播快、病死率高,且尚无特效药。故早期诊断、及时隔离病人和合理使用非特异性药物对症治疗是主要的治疗手段。因此,开发针对SARS病毒的灵敏、特异、快速、准确的实验室诊断方法是迫切需要的。这种方法的建立对于病人的早期诊治、药物疗效的评价以及阻断传染源的传播都有极为重要的科学意义。本研究分别表达了SARS全长N蛋白（nucleocapsid）及其长短不一的四个片段,并用SARS全长N蛋白免疫兔子和BALB/c小鼠制备了特异性的多克隆和单克隆抗体。Western Blotting检测发现,单克隆抗体不仅可以与大肠杆菌表达的N蛋白结合,而且能与SARS病毒感染的细胞裂解液中天然N蛋白发生反应,提示所制备的单抗能够识别天然的SARS N蛋白。为了获得所制备单抗识别表位的信息,用ELISA方法分析了6种N蛋白特异性单抗与N蛋白及其片段的反应性。根据结果可以把这6种单抗分成两组,A组单抗有两个,主要识别N蛋白中249-317氨基酸;B组单抗有四个,主要识别317-422氨基酸。这表明,N蛋白的B细胞表位主要位于其C端的221-422氨基酸区域。在两组抗体中各选择了一株高亲和力单抗作为包被抗体,N蛋白的多克隆抗体偶联辣根过氧化物酶为二抗,组装成双抗体夹心ELISA试剂盒。经验证,该试剂盒能特异性地检测出N蛋白,并且与非SARS病人血清（包括肿瘤患者、系统性红斑狼疮患者、乙肝和丙肝患者）无交叉反应。这些实验结果提示,所构建的N蛋白特异的ELISA试剂盒对SARS感染病人的早期诊断有潜在的应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一篇 实验部分
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 动物
• 1.1.2 溶液
• 1.1.3 培养液
• 1.1.4 其他
• 1.2 方法
• 1.2.1 SARS 冠状病毒 N 蛋白的表达及纯化
• 1.2.2 兔抗 N 蛋白抗血清的制备
• 1.2.3 抗 N 蛋白多抗的效价的测定
• 1.2.4 抗体的纯化和辣根过氧化物酶（HRP）的标记
• 1.2.5 抗 N 蛋白单克隆抗体的制备
• 1.2.6 Protein G 纯化抗体
• 1.2.7 Western Blotting
• 1.2.8 检测SARS 病毒抗原N 蛋白Sandwich ELISA 试剂盒的建立
• 2 结果
• 2.1 N 蛋白及其片段的表达和纯化
• 2.2 抗 N 蛋白多抗效价的测定
• 2.3 抗 N 蛋白单克隆抗体的制备
• 2.4 单抗识别表位的分析
• 2.5 选择单抗和多抗组成配对抗体检测 N 蛋白
• 2.6 Sandwich ELISA-Kit 检测人血清
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 第二篇 文献综述
• 单克隆抗体在基础研究和临床诊断与治疗中的应用
• 1 在基础研究中的应用
• 2 在临床诊断方面中的应用
• 3 在临床预防和治疗中的应用
• 参考文献
• 附录
• 已发表和待发表的文章
• 已申请的专利
• 致谢